排膿散對結(jié)腸癌小鼠的抗腫瘤作用

張孟孟芮雪琳楊 曄徐 莉尹登科

（1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥230012； 2.新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽 合肥230012；3.現(xiàn)代中藥研究與開發(fā)安徽省重點實驗室，安徽 合肥230012）

排膿散源自《金匱要略》，由枳實、芍藥、桔梗3 味中藥按5 ∶5 ∶2 的比例配伍組成［1］，具有排膿化毒、調(diào)理氣血、止痛等功效［2?3］，可用于腸癰、瘡癰等多種膿腫性疾病的治療［4］。現(xiàn)代病理實驗證明，該方對醋酸所致急性炎癥小鼠模型具有明顯的抗炎作用［5］，但機制仍未明確。

結(jié)腸癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，具有預(yù)后效果差、反復發(fā)作、高死亡率等特點［6?8］。近年來臨床研究表明，炎癥性腸病與結(jié)腸癌的發(fā)病率高度相關(guān)［9］，阻斷結(jié)腸炎癥向結(jié)腸癌演變是結(jié)腸癌二級預(yù)防的關(guān)鍵。本實驗旨在研究排膿散對致癌劑氧化偶氮甲烷和誘導劑葡聚糖硫酸鈉誘導結(jié)腸癌小鼠的抗腫瘤作用，以期為該方臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 氧化偶氮甲烷（美國Sigma 公司）；葡聚糖硫酸鈉（相對分子質(zhì)量36 000～50 000，中國大連美倫生物科技有限公司）。阿司匹林腸溶片（中國石家莊康力藥業(yè)有限公司）。枳實、白芍、桔梗由安徽合肥當?shù)刂兴幉氖袌鎏峁?jīng)安徽中醫(yī)藥大學劉守金教授鑒定為正品。IL?4、IFN?γ 兔抗鼠多克隆抗體（北京博奧森生物工程有限公司）；IL?6、TNF?α 兔抗鼠多克隆抗體（沈陽萬類生物工程有限公司）。其余試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器 DM2000 熒光顯微鏡（德國Leica 公司）；Milli?Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）。

1.3 動物 雄性Balb／c 小鼠（20±2）g，購于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（皖）2017?001。實驗開始前，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

2 方法

2.1 排膿散提取物制備 稱取120 g 組方藥材（枳實、白芍、桔梗比例為5 ∶5 ∶2），加入10 倍量超純水浸泡30 min，武火煮沸，文火煎煮30 min，過濾得一煎煎煮液；二煎加入8 倍量水，武火煮沸，文火煎煮25 min，過濾得二煎煎煮液，合并2 次煎煮液，濃縮至75 mL，即得，－20 ℃下保存待用。

2.2 分組與造模 32 只小鼠隨機分為對照組、模型組、陽性藥（阿司匹林）組、排膿散組，每組8只。其中，模型組小鼠于實驗開始第1 天將腹腔注射10 mg／kg 氧化偶氮甲烷，于第8～14、29～35、50～56 天攝取含2.5%葡聚糖硫酸鈉的飲用水，以建立結(jié)腸癌模型。

2.3 給藥 從實驗第8 天起直至造模結(jié)束，小鼠每天灌胃給藥。臨床上，排膿散給藥劑量為12 g 生藥／70 kg，阿司匹林為0.1 g／70 kg，按照小鼠給藥劑量換算方法［10］，排膿散組、陽性藥組小鼠給藥劑量分別為1.6 g 生藥／kg、13 mg／kg，而對照組、模型組灌胃給予相同容量的超純水，每周稱量體質(zhì)量。給藥結(jié)束后，收集小鼠結(jié)腸組織，測量長度，統(tǒng)計腫瘤數(shù)目，見圖1。

圖1 結(jié)腸癌小鼠模型建立方法Fig.1 Establishment method of colon cancer mouse model

2.4 免疫組化實驗 小鼠腸組織石蠟切片后常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水，PBS 緩沖液漂洗，在95 ℃10 mmol／L 枸櫞酸鈉溶液中修復20 min，冷卻至室溫，加入過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育10 min，PBS 緩沖液漂洗，加入山羊血清，37 ℃下孵育20 min，傾去血清（無需洗滌），分別滴加兔抗IL?4、IL?6、TNF?α、IFN?γ（均為1 ∶200 比例稀釋），4 ℃下孵育過夜，TBST 緩沖液漂洗，滴加適量辣根酶標山羊抗兔IgG 聚合物，37 ℃下孵育30 min，TBST 緩沖液漂洗，DAB 顯色1 min，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水透化，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察。每張切片隨機選取6 個視野（×200），采用Image?J 圖像分析系統(tǒng)進行分析，記錄積分光密度（IOD）值。

2.5 蘇木精?伊紅（HE）染色 小鼠腸組織石蠟切片后常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染色3 min，流水沖洗1 min，1%鹽酸乙醇分化5 s，流水沖洗1 min，返藍，伊紅染色15 s，流水沖洗1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透化，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察。每張切片隨機選取6 個視野（×200）觀察。

2.6 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 23.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 排膿散對小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長度及腫瘤個數(shù)的影響 與對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量降低，結(jié)腸長度縮短（P＜0.01）；與模型組比較，排膿散組小鼠腫瘤個數(shù)減少（P＜0.01），并具有抑制體質(zhì)量下降趨勢和結(jié)腸縮短的作用（P＜0.01），見圖2。

圖2 排膿散對小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長度、腫瘤個數(shù)的影響Fig.2 Effects of Painong Powder on body weight，colon length and tumor number of mice

3.2 小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài) 除對照組外，各組小鼠都觀察到炎性細胞浸潤。與對照組比較，模型組小鼠隱窩扭曲膿腫、淋巴細胞浸潤嚴重，腺體不典型增生，并可見異樣結(jié)構(gòu)；陽性藥組小鼠顯示出炎癥狀態(tài)，隱窩破壞，微絨毛缺失，炎癥細胞浸潤，腺體排布紊亂；排膿散組小鼠顯示輕微的前炎癥狀態(tài)，腸隱窩變淺，微絨毛數(shù)量減少并變短，見圖3。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)Fig.3 Pathological morphologies of colon tissues of mice in various groups

3.3 排膿散對小鼠結(jié)腸組織IL?6、TNF?α、IL?4、IFN?γ 蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織IL?6、TNF?α蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，排膿散組小鼠結(jié)腸組織IL?6、TNF?α 蛋白表達升高降低（P＜0.01），見圖4。

圖4 排膿散對小鼠結(jié)腸組織IL?6、TNF?α 蛋白表達的影響Fig.4 Effects of Painong Powder on the protein expressions of IL?6 and TNF?α in colon tissues of mice

與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織IL?4、IFN?γ 蛋白表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，排膿散組小鼠結(jié)腸組織IL?4、IFN?γ 蛋白表達升高（P＜0.01），見圖5。

圖5 排膿散對小鼠結(jié)腸組織IL?4、IFN?γ 蛋白表達的影響Fig.5 Effects of Painong Powder on the protein expressions of IL?4 and IFN?γ in colon tissues of mice

4 討論

腸道的慢性炎癥是結(jié)直腸癌發(fā)生的主要原因之一，因此阻止結(jié)腸炎向結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)變是防治結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌的一個重要手段［11］。中藥復方排膿散由枳實、芍藥、桔梗3 味中藥組成，配比精簡，廣泛應(yīng)用于瘡癰、腸癰等癥的治療。本研究考察了排膿散對結(jié)腸炎誘導的結(jié)腸癌的治療作用，排膿散能夠顯著緩解經(jīng)AOM／DSS 誘導建立的小鼠結(jié)腸癌模型體質(zhì)量下降趨勢，并抑制結(jié)腸長度縮短和模型小鼠的結(jié)腸腫瘤生長，證實排膿散對AOM／DSS 誘導的小鼠結(jié)腸癌有明顯的改善作用。

炎癥因子表達失衡在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，通過對結(jié)腸組織進行免疫組化染色和光密度值計算發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織IL?6 及TNF?α 表達水平升高，IL?4 及IFN?γ 表達水平降低；而排膿散給藥組中，上述指標均出現(xiàn)明顯逆轉(zhuǎn)趨勢。IL?6 及TNF?α 是腫瘤微環(huán)境中重要的促炎因子，AOM／DSS 誘導的結(jié)腸癌小鼠血清中往往IL?6 水平較高［11?13］，而TNF?α 可以誘導靶細胞DNA 突變、惡性轉(zhuǎn)化、細胞增殖以及血管增生，同時與腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，促進腫瘤的進展［14］。相反，炎性細胞分泌的抑炎細胞因子包括IL?4、IL?10 等則能夠抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生［15］。IFN?γ 是具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)的淋巴因子，具有誘導機體抗病毒狀態(tài)、抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡等作用［16］。因此，排膿散可能是通過改善結(jié)腸組織中促炎因子與抗炎因子的表達水平，從而抑制結(jié)腸炎小鼠炎癌轉(zhuǎn)變的進程。