補腎安胎合劑對腎虛流產小鼠EPCs 動員、歸巢的影響

江慧敏余欣慧李 赟張源源宣躍廷楊天平

（1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥230000； 2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥230000）

自然流產是指在自然狀態下非人為因素發生的流產，目前在我國的發生率為10%～15%，其中早期自然流產（孕周≤12 周）占比達80% 以上［1］，嚴重影響女性身心健康和今后妊娠［2?3］，其發病機制尚未完全明確，病因復雜多樣。目前，母胎界面血管新生障礙是國內外相關研究的焦點，母胎界面血管修復過程（即母胎界面血管重鑄）從細胞學角度而言，與血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的動員、歸巢息息相關，可被人體組織器官所釋放的生長因子、多種細胞因子和激素等物質所促進。

組織損傷后，血液會釋放VEGF、SDF?1α 等細胞因子，并通過SDF?1α／CXCR?4 軸使骨髓造血系EPCs 與骨髓間質細胞脫離，遷移至外周血［4］，即SDF?1α 參與該動員過程，然后EPCs 順著其濃度進入損傷部位，完成歸巢，表明SDF?1α／CXCR?4 信號轉導通路在胚胎發育、血管發育、心臟發育過程中發揮著關鍵的作用［5?6］。本實驗通過監測腎虛流產小鼠EPCs 動員、歸巢過程，探究補腎安胎合劑對自然流產的影響。

1 材料

1.1 動物 雌性綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）轉基因小鼠6 只（用于活體追蹤的活性骨髓來源干細胞），4 周齡，體質量（20±2）g；SPF 級雌性ICR 小鼠100 只（未產），3 周齡，體質量（19±2）g；SPF 級雄性ICR 小鼠50 只，3 周齡，體質量（20±2）g，均由江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（蘇）2018?0008，室內恒定溫度23～26 ℃，相對濕度40%～45%，在安徽中醫藥大學第一附屬醫院的動物實驗中心進行清潔級標準飼養，自由進食飲水，適應性飼養1 周后無異常后開始實驗。

1.2 藥物 補腎安胎合劑，購自安徽中醫藥大學第一附屬醫院（處方組成菟絲子、桑寄生、川斷、熟地等，皖藥制字BZ20080017）；羥基脲，購自齊魯制藥有限公司（國藥準字H37021289）；米非司酮片，購自安徽中醫藥大學第一附屬醫院（國藥準字H20033551）。

1.3 試劑 DMEM／F?12 培養基、Phsphate Buffered Saline（1×）、MEM／EBSS、改良型RPMI?1640 培養基，購自美國Hyclone 公司；胎牛血清（FBS），購自德國Sera＆Pro 公司；胰酶Trypsin、DMSO，購自美國Amresco公司；小鼠SDF?1α、CXCR4 ELISA 試劑盒，購自上海科順生物科技有限公司。

1.4 儀器 CO2恒溫培養箱，購自日本Sanyo 公司；潔凈工作臺，購自蘇州安泰空氣技術有限公司；生物倒置顯微鏡，購自重慶光電儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡，購自日本Nikon 公司；離心機，購自上海力康生物醫療科技控股有限公司；流式細胞儀，購自美國Beckman 公司；酶標儀，購自美國Bio?Rad 公司；水浴鍋，購自上海一恒科技有限公司；移液器、排槍，購自德國Eppendorf公司。

2 方法

2.1 模型建立

2.1.1 骨髓移植模型 參考文獻［7］ 報道。

2.1.1.1 GFP 轉基因小鼠骨髓單個核細胞的提取、分離、凍存 取6 周左右供體GFP 小鼠，脫臼處死，70%乙醇浸泡5 min，無菌分離供體鼠的股骨和脛骨，PBS 緩沖液沖洗數次，置于低糖的DMEM中剪碎，反復吹打沖出骨髓，過濾除去組織碎片，離心去上清，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養基，調整細胞濃度后接種于培養瓶里。48 h 后換液除去懸浮細胞，每3 d 進行1 次，凍存液將細胞懸浮起來，分裝到凍存管，置于液氮罐中保存備用。

2.1.1.2 野生型受體小鼠骨髓移植 采用X 線加速器放射源，對100 只雌性野生型ICR 小鼠全身進行均勻照射，總劑量8.0 Gy，劑量率0.53 Gy／min，放射后2 h 內每只受體鼠尾靜脈注射0.1 mL“2.1.1.1”項下單個核細胞懸液。小鼠骨髓重建4周后斷尾取血，保存于肝素鈉采血管中，EDTA 抗凝，樣品在4 ℃冰箱中保存，24 h 內用流式細胞儀測定骨髓中GFP 陽性細胞比例，以判斷造模成功與否。

2.1.2 腎虛流產模型 參考文獻［8?9］ 報道。將“2.1.1.2”項下造模成功的雌性小鼠與同種雄性小鼠合籠交配，建立正常妊娠模型，以檢出陰栓者或雌性小鼠陰道內見精子者為妊娠第0 天。在妊娠第1～9 天，雌性小鼠灌胃給予450 mg／kg 羥基脲進行造模，在妊娠第10 天上午灌胃給予4.0 mg／kg米非司酮，以復制腎虛流產模型。

2.2 分組與給藥 將40 只“2.1.1.2”項下造模成功、GFP 標記的骨髓移植雌性小鼠隨機分為4組，分別為模型組及中藥低、中、高劑量組，每組10 只，另取10 只GFP 標記的骨髓移植正常小鼠作為空白組，依據體表面積計算法、補腎安胎合劑臨床應用劑量換算成小鼠給藥劑量。模型組及中藥低、中、高劑量組小鼠分別灌胃給予生理鹽水及3.0、6.0、12.0 g／kg 補腎安胎合劑，而空白組小鼠灌胃給予生理鹽水，各組均連續給藥4 周。

2.3 小鼠胚胎丟失率檢測 剖視小鼠子宮，觀察胚胎丟失情況，計算胚胎丟失率，公式為丟失率＝［丟失胚胎數／（丟失胚胎數＋存活胚胎數）］×100%。

2.4 EPCs 數量檢測 處死小鼠，浸泡于75%乙醇中消毒，在超凈臺上無菌分離雙側股骨和脛骨，浸泡于PBS 緩沖液中，反復沖洗骨髓腔，制備骨髓單個核細胞懸液，采用流式細胞術檢測。采集經肝素鈉抗凝的外周血，直接采用流式細胞術檢測。蛻膜組織用PBS 緩沖液沖洗數次，制備單細胞懸液后，經流式細胞儀檢測GFP、Flk?1、Sca?1 陽性細胞占單核細胞的比例，通過Cell Quest 軟件分析單個核細胞中GFP＋／Flk?1＋／Sca?1＋的EPCs 占比。

2.5 外周血SDF?1α 水平及蛻膜組織CXCR?4 表達檢測 小鼠外周血離心后取上清液，采用ELISA法檢測SDF?1α 水平。將蛻膜組織制成混懸液后，采用ELISA 法檢測蛻膜組織CXCR?4 表達。

2.6 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，所有數據均先進行正態性檢驗，2 組間比較采取獨立樣本t檢驗，3 組及3組以上之間比較采取方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 GFP 骨髓嵌合率檢測 如圖1 所示，小鼠骨髓單個核細胞的GFP 陽性率為94.2%。骨髓移植后，小鼠死亡6 只，采用流式細胞儀測定其骨髓中GFP 陽性細胞比例，發現44 只造模失敗，50 只造模成功，成功率為53.2%。

圖1 骨髓移植小鼠GFP 陽性率Fig.1 GFP positive rates in bone marrow transplantation mice

3.2 小鼠胚胎丟失率 如表1 所示，空白組小鼠胚胎丟失率低于模型組、中藥低劑量組（P＜0.01）；模型組小鼠胚胎丟失率高于中藥各劑量組（P＜0.05，P＜0.01）；與中藥高劑量組比較，中藥低劑量組小鼠胚胎丟失率升高（P＜0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥中劑量組小鼠胚胎丟失率降低（P＜0.05）。

表1 各組小鼠流產率及胚胎丟失率比較（， n＝10）Tab.1 Comparison of abortion rates and embryo loss rates of mice among various groups（， n ＝10）

表1 各組小鼠流產率及胚胎丟失率比較（， n＝10）Tab.1 Comparison of abortion rates and embryo loss rates of mice among various groups（， n ＝10）

注：與空白組比較，■■P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與中藥高劑量組比較，●P ＜0.05；與中藥低劑量組比較，★P＜0.05。

3.3 小鼠骨髓EPCs 數量 如表2、圖2 所示，與空白組比較，模型組、中藥各劑量組小鼠骨髓EPCs 數量降低（P＜0.01）；與模型組比較，中藥高劑量組小鼠骨髓EPCs 數量升高（P＜0.01）；與中藥高劑量組比較，中藥中、低劑量組小鼠骨髓EPCs 數量降低（P＜0.01）。

圖2 小鼠骨髓流式細胞檢測Fig.2 Detection of bone marrow of mice by flow cytometry

表2 各組小鼠骨髓EPCs 數量比較（， n＝10）Tab.2 Comparison of EPCs counts in bone marrow of mice among various groups（， n＝10）

表2 各組小鼠骨髓EPCs 數量比較（， n＝10）Tab.2 Comparison of EPCs counts in bone marrow of mice among various groups（， n＝10）

注：與空白組比較，■■P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01；與中藥高劑量組比較，●●P＜0.01。

3.4 小鼠外周血EPCs 數量 如表3 所示，與空白組比較，模型組、中藥各劑量組小鼠外周血EPCs 數量降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組小鼠外周血EPCs 數量升高（P＜0.01）。

表3 各組小鼠外周血EPCs 數量比較（， n＝10）Tab.3 Comparison of EPCs counts in peripheral blood of mice among various groups（， n＝10）

表3 各組小鼠外周血EPCs 數量比較（， n＝10）Tab.3 Comparison of EPCs counts in peripheral blood of mice among various groups（， n＝10）

注：與空白組比較，■P ＜0.05，■■P ＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。

3.5 小鼠蛻膜組織EPCs 數量 如表4 所示，與空白組比較，模型組、中藥各劑量組小鼠蛻膜組織EPCs 數量降低（P＜0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組小鼠蛻膜組織EPCs 數量升高（P＜0.05，P＜0.01）；與中藥高劑量組比較，中藥低、中劑量組小鼠蛻膜組織EPCs 數量降低（P＜0.05，P＜0.01）；與中藥低劑量組比較，中藥中劑量組小鼠蛻膜組織EPCs 數量升高（P＜0.05）。

表4 各組小鼠蛻膜組織EPCs 數量比較（， n＝10）Tab.4 Comparison of EPCs counts in decidual tissue of mice among various groups（， n＝10）

表4 各組小鼠蛻膜組織EPCs 數量比較（， n＝10）Tab.4 Comparison of EPCs counts in decidual tissue of mice among various groups（， n＝10）

注：與空白組比較，■■P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與中藥高劑量組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01；與中藥低劑量組比較，★P＜0.05。

3.6 小鼠外周血SDF?1α 水平、蛻膜組織CXCR?4表達 如圖3 所示，空白組小鼠外周血SDF?1α 水平高于模型組及中藥低、中劑量組（P＜0.05，P＜0.01）；模型組小鼠外周血SDF?1α 水平低于中藥各劑量組（P＜0.01）；中藥低劑量組小鼠外周血SDF?1α 水平低于中藥中、高劑量組（P＜0.05）。與空白組比較，模型組小鼠蛻膜組織CXCR?4 表達低于中藥各劑量組（P＜0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組小鼠蛻膜組織CXCR?4 表達升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 各組小鼠外周血SDF?1α 水平、蛻膜組織CXCR?4 表達Fig.3 SDF?1α levels in peripheral blood and CXCR?4 expressions in decidual tissue of mice in various groups

4 討論

自然流產在中醫角度屬“胎漏”“胎動不安”“滑胎”“墮胎”“小產”范疇。歷代醫家多認為該病以腎虛為本，加之后天外感六淫，內傷七情等病因多造成脾的功能失司。腎氣不足，不能維系胞脈，以致胎失所系；脾氣虧虛，不能充養胞脈，以致胎失所養，二者相互影響，導致胎元不固。因此胞胎難以維系在于脾腎不足所致胞脈不系不充之病。胞脈為隸屬于胞宮之血脈，胞絡為絡屬于胞宮的脈絡，胞宮通過胞脈、胞絡與其他臟腑相聯系，它們將匯聚于沖任二脈的陰血下注與胞宮，并與足少陰腎經發生經絡上的聯系。胞脈是絡脈的組成部分，絡脈將一身氣血灌溉到臟腑組織內，是維持人體生命活動、保持內環境穩定的網絡結構［10］。中醫的絡脈較西醫的血管功能更甚，絡脈之血絡的功能與西醫微血管類似。因此，從血管角度研究中醫藥防治自然流產成為目前的研究熱點。

從現代醫學角度，由血管新生促進的母胎界面血管重鑄是妊娠維持的關鍵［11］。EPCs 在維持母體血管系統功能穩定及子宮胎盤形成過程中發揮重要作用，其可以通過動員、歸巢影響自然流產母胎界面血管重鑄［12］。在生理狀態下，骨髓EPCs 處于靜息狀態。當存在各種外源性或內源性因素干預骨髓局部的微環境時，會誘導干細胞穿過竇狀內皮離開骨髓進入血流。該動員過程，將EPCs 由骨髓轉移至外周血，增強代償性血管重建。研究表明，外周中SDF?1α表達上調可誘導EPCs動員［13?14］。當EPCs 動員到外周循環血中后，血管損傷部位產生釋放趨化因子如VEGF、SDF?1α，分別與EPCs 表面表達的受體VEGFR?2 及CXCR?4 相結合，EPCs順趨化因子梯度濃度趨化到內皮損傷部位或組織缺血部位；趨化過程完成后，EPCs 遷移至內皮細胞表面，侵襲入內皮下基質完成內皮修復。由此可見，SDF?1a 誘導的EPCs 動員和歸巢可能在母胎界面血管重鑄過程中扮演了重要角色。

補腎安胎合劑是我院的院內制劑，為壽胎丸加減而成，具有補腎健脾、益氣安胎的作用，唯有腎氣足、脾氣充方能使沖任匯聚精血于胞宮、胞脈，使胎元穩固，與現代醫學中，促進母胎界面血管生成有異曲同工之妙。我們既往已有制備腎虛流產模型進行研究，結果顯示流產大鼠母胎界面胰島素樣生長因子?1（IGF?1）與血管內皮因子VEGF 表達呈正相關，補腎安胎沖劑可以上調腎虛流產大鼠蛻膜IGF?1 和VEGF 表達［15］。郝樂樂等［16］通過復制正常妊娠模型、復發性流產模型后進行分組研究，結果顯示補腎安胎沖劑可通過調控VHL／HIF?1α 信號通路改善復發性流產小鼠母胎界面血管生成，從而降低流產率。本實驗在既往研究基礎上，著重對內皮祖細胞動員、歸巢的研究，由實驗結果可知：補腎安胎合劑可提高骨髓、外周血、蛻膜組織中EPCs 數目，其可能的機制與上調外周血SDF?1α水平與蛻膜組織中CXCR?4 表達有關。即補腎安胎合劑可通過促進骨髓EPCs 的動員、誘導EPCs 歸巢至母胎界面缺血部位，從而起到防治流產的發生，驗證了中醫“胞脈系于腎”“腎主骨生髓”、自然流產“從脾腎論治”的科學內涵。