芥子堿硫氰酸鹽增強HepG2 細胞對吉西他濱敏感性的作用

孫遠梅曾智銳王婧雅彭明兵雷 珊楊宇石蘭金芝張 毅陳騰祥*

（1.貴州醫科大學基礎醫學院生理教研室，貴州 貴陽550004； 2.貴州醫科大學附屬醫院病理科，貴州貴陽550004； 3.貴州醫科大學組織工程與干細胞實驗中心，貴州 貴陽550004； 4.貴州醫科大學附屬腫瘤醫院，貴州 貴陽550004）

肝細胞癌是常見的消化系統癌癥，發病率排第六位，也是第二常見的癌癥相關死亡原因［1?2］，由于其發病具有隱匿性的特征，一般被確診時就已處于晚期，僅有20% 患者有機會接受手術治療［3］。化療仍是治療肝癌的重要策略，其中吉西他濱是重要相關藥物，但其長期使用會增強癌細胞的多藥耐藥性而降低其療效。

肝癌細胞多藥耐藥性的機制有許多，其中一個重要的是ABCB1（也叫做p?糖蛋白）、ABCG2 蛋白的上調，其作用底物廣泛，可將包含吉西他濱在內的抗腫瘤藥物從細胞內外排出去，進而降低其含量，導致不能在細胞內達到有效閾值［4］。因此，尋找有效的藥物來靶向抑制ABCB1、ABCG2 蛋白，增強細胞對吉西他濱的敏感性是治療肝癌的有效策略。

十字花科植物是常見草本藥物，其根和葉均具有清熱消毒、涼血消瘢的功效，芥子堿硫氰酸鹽是從該類植物中提取出的活性成分，具有抗氧化、放射性保護等活性［5］，能抑制胰島素小鼠血糖上升，進而延緩肝脂肪性變［6］；作為一種益生元制劑，可預防腸道失調和肥胖相關的慢性疾病，如胰島素抵抗（IR）、非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）［7］；還具有良好抗腫瘤的作用，可抑制結腸腺癌細胞Caco?2 的增殖［8］，并能逆轉乳腺癌細胞的化學耐藥性［9］，但該成分對肝癌細胞的作用及其機制仍不清楚。因此，本實驗探討芥子堿硫氰酸鹽增強肝癌細胞HepG2 對吉西他濱敏感性的作用，以期為相關臨床治療提供新的治療策略和實驗依據。

1 材料

1.1 細胞株 人肝癌細胞HepG2，購自美國ATCC 細胞庫。

1.2 藥物 吉西他濱（批號HY?17026）、芥子堿硫氰酸鹽（批號HY?N0450），均購自武漢MCE 生物公司，DMSO 制成10 mmol／L 母液，－20 ℃下保存，用時以含10%胎牛血清的DMEM 培養基稀釋成不同濃度的工作液。

1.3 試劑 DMEM 培養基（批號11965092）、胎牛血清（FBS，批號26010074）、0.25% 的胰蛋白酶（批 號25200072），購自美國 Gibco公司。DMSO（批號D2650），購自美國Sigma 公司；羅丹明123 染料（批號R8030），購自北京索萊寶科技有限公司；CCK?8 試劑（批號AR1199）、PMSF 酶抑制劑（批號AR1192）、蛋白裂解液RIPA（批號AR0102）、BCA 試劑盒（批號AR1189）、5×蛋白上樣緩沖液（批號AR1112）、SDS?PAGE 膠制膠試劑盒（批號AR0138）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔（批號BA1054）、山羊抗鼠二抗（批號BA1050），購自武漢博士德生物工程有限公司；AnnexinV?FITC／PI凋亡檢測試劑盒（批號MA0220），購自大連美侖生物技術有限公司；PVDF 膜（批號ISEQ00010），購自美國Millipore公司；脫脂奶粉（批號G5002），購自武漢賽維爾生物科技有限公司；鼠源性單克隆抗β?actin（批號60008?1?Ig）、兔源性多克隆抗ABCB1（批號22336?1?AP）、兔源性多克隆抗ABCG2（批 號27286?1?AP）、兔源性多克隆抗Caspase?8（批號13423?1?AP）、兔源性多克隆抗Bcl?2（批號12789?1?AP）、兔源性多克隆抗Bax（批號50599?2?Ig），購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔源性多克隆抗cleave?caspase8（批號9496），購自美國CST 公司；高敏ECL 曝光液（批號R30199），購自北京雷根生物技術有限公司公司。

2 方法

2.1 細胞培養 人肝癌細胞HepG2 用含10%FBS的DMEM 培養，放入37 ℃、5%CO2的培養箱中，當細胞匯合度達80%時用胰酶消化傳代，取狀態良好的對數生長期者進行實驗。

2.2 芥子堿硫氰酸鹽與ABCB1、ABCG2 蛋白結合能力的分子對接分析 從Protein Data Bank（ht?tps：／ ／www.rcsb.org／）數據庫下載ABCB1 蛋白的晶體結構和ABCG2 蛋白的晶體結構（ID：6COV、6ETI），同時從PubChem Compound 數據庫（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／pccompound／）下載芥子堿硫氰酸鹽的三級結構。ABCB1、ABCG2的晶體結構及芥子堿硫氰酸鹽的三級結構均導入SYBYL 軟件，對蛋白晶體結構清除原結合分子、修復黏性末端、加氫、自動識別活性口袋后，采用DOCKING 功能對接芥子堿硫氰酸鹽與ABCB1、ABCG2 的活性口袋，根據結合打分（C?score 0～5分）來判斷分子與蛋白穩定結合的可能性，C?score 在4～5 分范圍內時，可認為分子與蛋白能穩定結合［10］。

2.3 HepG2 細胞外排藥物能力檢測 肝癌HepG2細胞以1×105／孔濃度接種于6 孔板上，待細胞貼壁后加入0、12.5、25、50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽處理24 h，胰酶消化成細胞懸液，離心收集細胞，重懸于培養基中，加入10 mmol／L 羅丹明123染液，在培養箱中避光孵育30 min 后PBS 緩沖液洗滌3 次，清除細胞外游離的羅丹明123 染料。將細胞重懸于PBS 緩沖液中，流式細胞儀（激發波長488 nm）檢測其熒光強度，判斷羅丹明123 在細胞內的累積程度，其累積越多，細胞外排藥物能力越弱。

2.4 CCK?8 實驗 取對數生長期的HepG2 細胞，用胰酶消化后制成細胞懸液接種于96 孔板中（3 000／孔），檢測芥子堿硫氰酸鹽對HepG2 細胞增殖的影響時，細胞分別給予0、12.5、25、50 μmol／L芥子堿硫氰酸鹽處理；檢測芥子堿硫氰酸鹽對吉西他濱的增敏作用時，細胞分別給予0、2.5、5、10、20 μmol／L 吉西他濱或聯合50 μmol／L芥子堿硫氰酸鹽處理。48 h 后，除去舊培養基，每孔加入CCK?8 溶液10 μL、無血清培養基90 μL，放入培養箱中繼續培養，2 h 后用酶標儀檢測450 nm波長下各孔光密度（OD）值，以0 μmol／L處理為對照孔，只含CCK?8 溶液的DMEM 培養基的孔為調零孔，計算存活率，公式為存活率＝［（實驗組OD值－調零孔OD值）／（對應的對照組OD值－調零孔OD值）］ ×100%。吉西他濱單獨用藥和聯合芥子堿硫氰酸鹽時，對HepG2 細胞的IC50是在GraphPad 軟件中根據各濃度對應的增殖率構建非線性回歸函數公式推導得出，同時根據金氏公式，即聯合指數（CI）＝ABi／ ［Ai＋（1－Ai）×Bi］ 計算藥物聯合指數，CI＞1.15 表示兩藥聯合效果強于兩藥效單純疊加。

2.5 克隆平板實驗 用胰酶消化對數生長期的HepG2 細胞，離心后混勻制成細胞懸液，細胞計數后接種于6 cm 小皿中（2 000／皿），待細胞貼壁后分別給予等體積DMSO、5 μmol／L 吉西他濱、50 μmol／L芥子堿硫氰酸鹽、5 μmol／L 吉西他濱＋50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽處理HepG2 細胞。處理后第11 天除去舊培養基，用4%多聚甲醛在常溫下固定細胞30 min，再用0.5% 結晶紫染色30 min，雙蒸水洗凈多余的結晶紫溶液，放入孵箱內烘干，相機拍照，計算克隆形成數。

2.6 HepG2 細胞凋亡檢測 采用流式細胞術。取對數生長期的2×105／孔HepG2 細胞，接種于6 孔板中。待細胞貼壁后給予等體積DMSO、5 μmol／L吉西他濱、50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽、5 μmol／L吉西他濱＋50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽處理HepG2細胞。24 h 后，用胰酶將細胞消化，收集于離心管中，1 000 r／min（離心半徑8 cm）離心5 min，棄上清，PBS 緩沖液洗滌后再離心5 min，沉淀收集于流式管中，每管加入binding buffer 150 μL、PI染液4 μL、FITC 染液2 μL，混勻，錫紙包裹后置于4 ℃冰箱中15 min 后，采用流式細胞儀［艾森生物（杭州）有限公司］ 檢測細胞凋亡情況，總凋亡率＝晚期凋亡率＋早期凋亡率。

2.7 HepG2 細胞中ABCB1、ABCG2、Cleave caspase?8、Bcl?2、Bax蛋白表達檢測采用Western blot 法。等體積DMSO、5 μmol／L 吉西他濱、50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽、5 μmol／L 吉西他濱＋50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽處理HepG2 細胞24 h后，加入含2% PMSF 蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液RIPA 裂解，將裂解液收集于離心管中，4 ℃下12 000 r／min（離心半徑15 cm）離心15 min，收集蛋白上清液，用BCA 試劑盒測定各組蛋白濃度，樣品置于－80 ℃冰箱中保存，以40 μg／孔上樣于10% SDS?PAGE 上，90 V 恒定電壓電泳2 h 后310 mA 恒定電流轉膜2 h 至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉在常溫下封閉2 h，分別加入稀釋度1 ∶1 000的一抗（ABCB1、ABCG2、caspase?8、Cleave caspase?8、Bcl?2、Bax、β?actin），置于4 ℃冰箱中過夜，TBST 洗滌3 次，加入稀釋度1 ∶2 000的山羊抗鼠或兔二抗，室溫下孵育2 h，TBST 洗滌3次，加入高敏ECL 曝光液，采用凝膠成像儀（美國Bio?Rad公司）進行曝光。ABCB1、ABCG2、Bcl?2、Bax 蛋白相對表達量＝目的條帶灰度值／β?actin 灰度值，Cleave caspase?8 相對表達量＝Cleave caspase?8 條帶灰度值／caspase?8 條帶灰度值。

2.8 統計學分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，各實驗均獨立重復3 次，計量資料以（）表示，2 組間比較采用獨立t檢驗，多組間比較采用多因素方差分析和LSD?t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 芥子堿硫氰酸鹽與多耐藥相關蛋白ABCB1 和ABCG2 的對接 芥子堿硫氰酸鹽與ABCB1、ABCG2 活性位點的對接打分（C?scrore）分別為4、5 分，見圖1，提示該成分可穩定結合這2 種多耐藥相關蛋白。

圖1 芥子堿硫氰酸鹽與多耐藥相關蛋白ABCB1、ABCG2 的對接Fig.1 Docking of sinapine thiocyanate to multi?drug resistance related proteins ABCB1 and ABCG2

3.2 芥子堿硫氰酸鹽減少HepG2 外排藥物能力隨著芥子堿硫氰酸鹽濃度增加，HepG2 細胞中羅丹明123 波峰不斷右移，見圖2，提示該成分可減少HepG2 細胞藥物外排能力，導致羅丹明123 在細胞中累積增多。

圖2 不同濃度芥子堿硫氰酸鹽對HepG2 細胞中羅丹明123 外排的影響Fig.2 Effects of different concentrations of sinapine thio?cyanate on rhodamine 123 efflux in HepG2 cells

3.3 芥子堿硫氰酸鹽增強HepG2 細胞對吉西他濱敏感性的作用 25、50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽可減少肝癌HepG2 細胞增殖（P＜0.05），見表1，再以不同濃度吉西他濱單獨或聯合50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽處理肝癌HepG2 細胞，細胞增殖率見表2。由此可知，吉西他濱單獨用藥時對HepG2 細胞的48 h IC50為15.48 μmol／L，而聯合50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽后為5.34 μmol／L，提示該成分能增強HepG2 細胞對吉西他濱的敏感性。同時，5 μmol／L吉西他濱與50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽有最大聯合指數，故將其用于后續研究。

表1 不同濃度芥子堿硫氰酸鹽對HepG2 增殖的影響（， n＝3）Tab.1 Effects of different concentrations of sinapine thio?cyanate on the proliferation of HepG2 cells（，n＝3）

表1 不同濃度芥子堿硫氰酸鹽對HepG2 增殖的影響（， n＝3）Tab.1 Effects of different concentrations of sinapine thio?cyanate on the proliferation of HepG2 cells（，n＝3）

注：與0 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽組比較，*P＜0.05。

表2 不同濃度吉西他濱單獨用藥或聯合50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽對HepG2 細胞增殖的影響（， n＝3）Tab.2 Effects of different concentrations of gemcitabine in single use or combinative use with 50 μmol／L si?napine thiocyanate on the proliferation of HepG2 cells（， n＝3）

表2 不同濃度吉西他濱單獨用藥或聯合50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽對HepG2 細胞增殖的影響（， n＝3）Tab.2 Effects of different concentrations of gemcitabine in single use or combinative use with 50 μmol／L si?napine thiocyanate on the proliferation of HepG2 cells（， n＝3）

注：與0 μmol／L 吉西他濱組比較，*P＜0.05。

3.4 芥子堿硫氰酸鹽聯合吉西他濱對HepG2 細胞克隆形成的影響 對照組（DMSO 處理）、5 μmol／L吉西他濱組、50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽組、5 μmol／L吉西他濱＋50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽組HepG2 細胞克隆形成的個數分別為（1 335±87）、（1 002±66）、（870±55）、（289±42）個，見圖3。與對照組比較，給藥組HepG2 細胞克隆形成能力均減弱（P＜0.05）；與5 μmol／L 吉西他濱組、50 μmol／L芥子堿硫氰酸鹽組比較，5 μmol／L 吉西他濱＋50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽組克隆形成能力減弱（P＜0.05），提示芥子堿硫氰酸鹽能增強吉西他濱對HepG2 克隆形成的抑制能力。

圖3 吉西他濱、芥子堿硫氰酸鹽及其聯合對HepG2 細胞克隆形成的影響Fig.3 Effects of gemcitabine，sinapine thiocyanate and their combination on HepG2 cell colony formation

3.5 芥子堿硫氰酸鹽聯合吉西他濱對HepG2 凋亡的影響對照組、5 μmol／L吉西他濱組、50 μmol／L芥子堿硫氰酸鹽組、5 μmol／L 吉西他濱＋50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽組細胞凋亡率分別為（1.45 ± 0.32）%、（5.11 ± 0.67）%、（8.62 ±0.81）%、（23.53% ±1.73）%，見圖4。與對照組比較，給藥組HepG2 細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與5 μmol／L 吉西他濱組、50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽組比較，5 μmol／L 吉西他濱＋50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽組HepG2 細胞凋亡率升高（P＜0.05），提示芥子堿硫氰酸鹽能增強吉西他濱誘導HepG2凋亡的能力。

圖4 吉西他濱、芥子堿硫氰酸鹽及其聯合對HepG2 細胞凋亡的影響Fig.4 Effects of gemcitabine，sinapine thiocyanate and their combination on HepG2 cell apoptosis

3.6 芥子堿硫氰酸鹽聯合吉西他濱對肝癌HepG2細胞中ABCB1、ABCG2、Cleave caspase?8、Bcl?2、Bax 表達的影響 與對照組比較，5 μmol／L 吉西他濱組HepG2 細胞中Cleave caspase?8、Bax 表達升高（P＜0.05），Bcl?2 表達降低（P＜0.05），50 μmol／L芥子堿硫氰酸鹽組、5 μmol／L 吉西他濱＋50 μmol／L芥子堿硫氰酸鹽組HepG2 細胞中ABCB1、ABCG2、Bcl?2 表達降低（P＜0.05），Cleave caspase?8、Bax 表達升 高（P＜0.05）；與5 μmol／L吉西他濱組、50 μmol／L芥子堿硫氰酸鹽組比較，5 μmol／L 吉西他濱＋50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽組Cleave caspase?8、Bax 表達升高（P＜0.05），Bcl?2 表達降低（P＜0.05），見表3、圖5，提示芥子堿硫氰酸鹽能通過抑制ABCB1、ABCG2 表達來增強吉西他濱誘導的Bcl?2 減少及Cleave caspase?8、Bax 的增加。

圖5 吉西他濱、芥子堿硫氰酸鹽及其聯合對HepG2 細胞中ABCB1、ABCG2、Cleave caspase?8、Bcl?2、Bax表達的影響Fig.5 Effects of gemcitabine，sinapine thiocyanate and their combination on the expressions of ABCB1，ABCG2，Cleave caspase?8，Bcl?2 and Bax in HepG2 cells

表3 吉西他濱、芥子堿硫氰酸鹽及其聯合對HepG2 細胞中ABCB1、ABCG2、Cleave caspase?8、Bcl?2、Bax 表達的影響（， n＝3）Tab.3 Effects of gemcitabine，sinapine thiocyanate and their combination on the expressions of ABCB1，ABCG2，Cleave caspase?8，Bcl?2 and Bax in HepG2 cells（， n＝3）

表3 吉西他濱、芥子堿硫氰酸鹽及其聯合對HepG2 細胞中ABCB1、ABCG2、Cleave caspase?8、Bcl?2、Bax 表達的影響（， n＝3）Tab.3 Effects of gemcitabine，sinapine thiocyanate and their combination on the expressions of ABCB1，ABCG2，Cleave caspase?8，Bcl?2 and Bax in HepG2 cells（， n＝3）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與5 μmol／L 吉西他濱組比較，ΔP＜0.05；與50 μmol／L 芥子堿硫氰酸鹽比較，＃P＜0.05。

4 討論

肝癌是致死率排第二的惡性腫瘤。由于肝癌發病隱匿，大部分肝癌患者診斷時，就失去了手術的機會。然而，由于肝癌細胞對多種化療藥物不敏感，肝癌患者的化療緩解率低；此外，大劑量的化療藥物會造成嚴重的心臟、腎臟等毒性作用［11］。因此，尋找新的藥物增強肝癌細胞對化療藥物的敏感性是肝癌治療的一個有效策略。

中藥及其有效成分具有藥效溫和、毒副作用小等優點，是重要的藥物開發庫［12］。目前，多種中藥及其有效成分已證實能夠通過抑制ABCB1 和ABCG2 等轉運蛋白的表達，增強肝癌細胞對化療藥物的敏感性。如蟾毒靈是中藥蟾酥的有效成分之一，能夠通過抑制ABCB1 的表達，增強肝癌細胞對5?FU 的敏感性［13］；苦參的活性成分苦參素靶向ABCG2 逆轉肝癌細胞對阿霉素的耐藥性［14］。基于ABCB1 和ABCG2 在調控化療藥物敏感性中扮演著重要角色，為挖掘可抑制ABCB1 和ABCG2 功能的藥物，本研究通過計算機對接發現芥子堿硫氰酸鹽能夠與ABCB1 和ABCG2 蛋白的活性口袋結合；同時利用羅丹明123 實驗發現，芥子堿硫氰酸鹽能夠降低肝癌細胞外排藥物的能力。

吉西他濱是治療肝癌的一個重要化療藥物，其主要是通過干擾細胞DNA 合成過程，抑制肝癌細胞增殖，誘導細胞凋亡［15］。但是，吉西他濱也是ABCB1 和ABCG2 的底物，在予以高劑量吉西他濱治療時，細胞中的ABCB1 和ABCG2 蛋白介導吉西他濱持續外排，致使細胞內的吉西他濱無法達到有效殺傷的閾值濃度［16］。在本研究中，通過CCK?8、克隆形成和凋亡實驗發現，芥子堿硫氰酸鹽能夠增強肝癌細胞對吉西他濱的敏感性，增強吉西他濱抑制肝癌細胞克隆形成以及誘導凋亡的能力；通過Western blot 實驗發現，芥子堿硫氰酸鹽能夠通過抑制ABCB1 和ABCG2 的表達，增強吉西他濱介導的Bcl?2 減少以及Cleave caspase?8 和Bax 的增加。

綜上所述，芥子酸堿硫氰酸鹽靶向抑制ABCB1 和ABCG2，增強肝癌細胞對吉西他濱的敏感性。芥子堿硫氰酸鹽聯合吉西他濱可能是治療肝癌的一種有效策略。