延丹膠囊對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌缺血的作用及機制

焦 杰馬星月傅 強馬世平馬占強

（中國藥科大學，江蘇 南京211198）

近年來，心血管疾病發生率逐漸上升，死亡率高達32%［1］，其中心肌缺血是引起心絞痛、心肌梗死、心力衰竭等多種心血管疾病的主要原因［2?4］，其臨床癥狀大多表現為心慌、胸悶或胸痛，常用藥物有抗血小板藥、β 受體阻斷劑、鈣離子拮抗劑等，但長期服用西藥容易產生不良反應，故研發相關中藥逐漸成為趨勢。異丙腎上腺素誘導大鼠心肌缺血損傷模型為研究心肌缺血經典模型之一［5］，大劑量該藥物通過自由基急速生成和聚集，會導致心肌缺血缺氧而形成模型［6］。延丹膠囊為活血化瘀、理氣止痛的中成藥之一，臨床上廣泛用于治療冠心病勞累性心絞痛氣滯血瘀證，但其機制尚不明確，本實驗考察該制劑對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌缺血損傷的改善作用及機制，以期為其臨床合理應用提供指導。

1 材料

1.1 試劑與藥物 延丹膠囊［天長億帆制藥有限公司，批號190602，主要組方藥材為丹參、延胡索（醋制）、五靈脂、瓜蔞、乳香（醋制）、白芍、枳殼和柴胡］；通心絡膠囊（石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號A1811042）；鹽酸異丙腎上腺素（美國Sigma 公司，批號WXBC9656V）；生理鹽水注射液（安徽雙鶴藥業有限責任公司，批號17011903C）。水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號20160705）；甲醛（西隴科學股份有限公司，批號1908032）；MDA（批號20191030）、T?SOD（批號20191030）、AST（批號20191031）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；HIF?1α檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批 號 2ENRG14UI4 ）；IL?1β（批 號E20191001A）、TNF?α（批號E20191001A）檢測試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司）；Nrf2 抗體（貨號16396?1?AP）、HO?1 抗體（貨號10701?1?AP）、GAPDH 抗體（貨號10494?1?AP）（武漢三鷹生物技術有限公司）；p53 抗體［圣克魯斯生物技術（上海）有限公司，貨號sc?126］；Bcl?2抗體（貨號ab59348）、Bax 抗體（貨號ab32503）［艾博抗（上海）貿易有限公司］。

1.2 動物 SPF 級SD 大鼠60 只，雌雄各半，體質量（200±20）g，購于南京市江寧區青龍山動物繁殖場，動物生產許可證號SCXK（蘇）2017?0001，在標準實驗條件下［溫度（25±2）℃、相對濕度（60±5）%］ 適應性飼養1 周后隨機分組，正常晝夜節律，自由進食飲水。

1.3 儀器 BL?420N 生物信號采集與分析系統（成都泰盟軟件有限公司）；電子分析天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；全波長酶標儀（美國Thermo 公司）；KD?BM 生物組織包埋機（北京世紀科信科學儀器有限公司）；RM2235 切片機（德國Leica 公司）；BX53 正置生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；EPS600 電泳儀、全自動數碼凝膠／化學發光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）；Western blot 轉膜儀（美國Bio?Rad 公司）。

2 方法

2.1 造模及給藥 60 只大鼠隨機分為空白組，模型組，通心絡膠囊組（200.57 mg／kg）及延丹膠囊低、中、高劑量組（154、308、616 mg／kg），其中延丹膠囊中劑量組為臨床用量（人與大鼠等效劑量換算比例為1 ∶6），連續灌胃給藥8 d，劑量均為1 mL／100 g（空白組、模型組大鼠給予等量的生理鹽水）。第6～8 天給藥30 min 后，除空白組外其余各組大鼠腹腔注射40 mg／kg 異丙腎上腺素，連續3 d，用于構建急性心肌缺血模型（空白組大鼠腹腔注射等量生理鹽水）。

2.2 大鼠心電圖監測 第6 天灌胃給藥30 min后，10%水合氯醛麻醉大鼠，空白組大鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組大鼠腹腔注射40 mg／kg 異丙腎上腺素，并立即行肢體Ⅱ導聯心電圖檢查，記錄ST 段變化。

2.3 大鼠血清因子檢測 第8 天灌胃給藥30 min后，沿大鼠腹部正中線切開，打開腹腔，腹主動脈采血至無菌試管中，靜置30 min 后3 000 r／min 離心15 min，分離血清，采用全波長酶標儀檢測MDA、T?SOD、AST、HIF?1α、TNF?α、IL?1β 水平，嚴格按照相應試劑盒說明書中的方法進行操作。

2.4 大鼠心肌組織病理學檢查 第8 天灌胃給藥30 min 后，沿大鼠腹部正中線切開，打開胸腔，取出心臟，選取左心室組織，置于裝有10% 甲醛溶液的離心管中固定48 h，HE 染色觀察心肌組織病理變化。

2.5 大鼠心臟組織相關蛋白表達檢測（Western blot 法）稱取200 mg 大鼠左心室組織，加入液氮，在研缽中充分研磨，加入裂解液充分混勻，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r／min 離心30 min，取上清液，BCA 試劑盒進行蛋白定量并調整濃度；蛋白變性后上樣，電泳，轉膜，加入一抗，4 ℃下孵育過夜，TBST 清洗后加入二抗，室溫下孵育2 h，TBST 清洗，加入ECL 發光液曝光，掃描圖像后通過Image J 軟件進行分析，以目的蛋白灰度值／內參GAPDH 灰度值的比值為目的蛋白相對表達。

2.6 大鼠心臟組織相關蛋白表達檢測（免疫組化法）各組取3 只大鼠心臟，10%福爾馬林固定，經脫水、石蠟包埋后常規切片4 μm，再依次進行脫蠟、水化、抗原修復、一抗孵育、二抗孵育、蘇木精核染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、晾干，在顯微鏡下對左心室心肌細胞進行觀察并拍照，通過Image J 軟件對圖片進行陽性細胞率統計。

2.7 統計學分析 通過GraphPad Prism 5.01 軟件進行處理，結果以（）表示，除心電圖數據組間比較采用t檢驗外，其余數據組間比較均采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠心電圖 與空白組比較，模型組大鼠ST段升高（P＜0.01）；與模型組比較，延丹膠囊各劑量組大鼠心電圖ST 段降低（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

表1 延丹膠囊對心肌缺血大鼠心電圖ST 段的影響（，n＝7）Tab.1 Effect of Yandan Capsules on ST segment of myo?cardial ischemic rats（， n＝7）

表1 延丹膠囊對心肌缺血大鼠心電圖ST 段的影響（，n＝7）Tab.1 Effect of Yandan Capsules on ST segment of myo?cardial ischemic rats（， n＝7）

注：與空白組比較，＃＃ P ＜0.01；與模型組比較，* P ＜0.05，**P＜0.01。

3.2 大鼠心肌組織病理學 空白組大鼠心肌細胞排列整齊有序，橫紋清晰，無纖維結構改變，無大量炎性細胞浸潤；模型組大鼠橫紋斷裂，心肌細胞排列紊亂，出現肌絲溶解，大量炎性細胞浸潤等病理變化；延丹膠囊中、高劑量組大鼠心肌組織病變明顯改善，見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化（HE，×400）Fig.1 Pathological changes of myocardial tissues of rats in various groups（HE，×400）

3.3 大鼠血清MDA、T?SOD、AST 水平 與空白組比較，模型組大鼠血清MDA、AST 水平升高（P＜0.01），T?SOD 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，延丹膠囊各劑量組大鼠血清MDA、AST水平降低（P＜0.05，P＜0.01），T?SOD 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖2。

圖2 延丹膠囊對心肌缺血大鼠血清MDA、T?SOD、AST 水平的影響Fig.2 Effects of Yandan Capsules on serum levels of MDA，T?SOD and AST in myocardial ischemic rats

3.4 大鼠血清HIF?1α 水平 與空白組比較，模型組大鼠血清HIF?1α 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，延丹膠囊各劑量組大鼠血清HIF?1α 水平降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 延丹膠囊對心肌缺血大鼠血清HIF?1α 水平的影響Fig.3 Effect of Yandan Capsules on serum HIF?1α level in myocardial ischemic rats

3.5 大鼠血清TNF?α、IL?1β 水平 與空白組比較，模型組大鼠血清TNF?α、IL?1β 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，延丹膠囊各劑量組大鼠血清TNF?α 水平降低（P＜0.01），而IL?1β 水平雖也有降低趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 延丹膠囊對心肌缺血大鼠血清TNF?α、IL?1β 水平的影響Fig.4 Effects of Yandan Capsules on serum levels of TNF?α and IL?1β in myocardial ischemic rats

3.6 大鼠心臟組織Nrf2／HO?1／p53 信號通路相關蛋白表達 與空白組比較，模型組大鼠心臟組織Nrf2、HO?1 蛋白表達降低（P＜0.01），p53 蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，延丹膠囊各劑量組大鼠心臟組織Nrf2、HO?1 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），p53 蛋白表達降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 延丹膠囊對心肌缺血大鼠心臟組織Nrf2／HO?1／p53 信號通路相關蛋白表達的影響Fig.5 Effects of Yandan Capsules on proteins associated with Nrf2／HO?1／p53 signaling pathway in cardiac tissues of rats with myocardial ischemia

3.7 大鼠心臟組織Bcl?2／Bax 蛋白表達 與空白組比較，模型組大鼠心臟組織Bcl?2／Bax 蛋白表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，延丹膠囊各劑量組大鼠心臟組織Bcl?2／Bax 蛋白表達升高（P＜0.01），見圖6。

3.8 大鼠心臟組織Nrf2、p53 蛋白表達 與空白組比較，模型組大鼠心臟組織Nrf2 蛋白表達的陽性細胞率降低（P＜0.01），p53 蛋白表達的陽性細胞率升高（P＜0.01）；與模型組比較，延丹膠囊各劑量組大鼠心臟組織Nrf2 蛋白表達升高（P＜0.05），p53 蛋白表達的陽性細胞率降低（P＜0.01），見圖7。

圖7 延丹膠囊對心肌缺血大鼠心臟組織Nrf2、p53 蛋白表達的影響（×400）Fig.7 Effects of Yandan Capsules on Nrf2 and p53 protein expressions in cardiac tissues of rats with myocardial ischemia（×400）

4 討論

心肌缺血臨床表現多為心電圖ST 段抬高，而其抬高程度可以反應心肌缺血和心肌損傷的程度，是作為評價心肌缺血程度的標志之一［7］。MDA 和SOD 作為氧化應激的主要指標，在大鼠發生心肌缺血損傷后將產生急劇變化［8］。AST 主要分布在心肌中，正常時血清的AST 水平較低，當細胞受損時，細胞膜通透性增加，胞漿內AST 釋放入血。同時，伴隨炎癥因子的釋放，心肌損傷得以進一步加劇。HIF?1α 在缺氧環境下穩定表達，介導組織對缺氧、低氧的適應，并在缺氧條件下維持組織和細胞的穩態［9?10］。其濃度與氧濃度存在密切關系，氧濃度越低，HIF?1α 表達越高。通過觀察心肌缺血大鼠心電圖ST 段的變化、心肌組織病理變化，以及MDA、AST 及炎癥因子等指標水平的變化，可以發現延丹膠囊能有效的降低急性心肌缺血大鼠ST 段異常抬高，減輕心肌組織的病理損傷程度，顯著降低大鼠血清MDA、AST、HIF?1α 和TNF?α水平，顯著升高T?SOD 水平，但對血清IL?1β 水平并沒有影響。因此，延丹膠囊對異丙腎上腺素致SD 大鼠急性心肌缺血損傷具有良好的保護作用，其作用與改善細胞氧化應激及炎癥水平相關。

Nrf2 是保護細胞免受氧化應激的最主要的正向調節因子。正常條件下，Nrf2 與接頭Keap1 結合形成復合物，當發生氧化應激時，Nrf2 與Keap1 解離，進入細胞核，與抗氧化反應原件（antioxidant response element，ARE）相互結合，從而激活下游基因表達［11?12］。其中，HO?1 即其經典下游之一。HO?1 是新近發現的一種最廣泛存在的抗氧化酶，通常呈低水平表達，當受到傷害性刺激后水平明顯升高，是拮抗氧化應激的關鍵轉錄因子［13］。p53／Bax／Bcl?2 信號通路是研究心肌缺血后細胞凋亡的經典通路之一。p53 可通過Bax／Bcl?2 完成對細胞凋亡的調控作用。Bcl?2 可阻止凋亡形成因子如細胞色素C 等從線粒體釋放出來，具有抗凋亡作用，而Bax 可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導細胞色素C 的釋放，具有促凋亡作用，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間的平衡決定了細胞在受到一定刺激或損傷后存活或凋亡的可能性［14?15］。而p53 可以上調Bax 的表達水平，以及下調Bcl?2的表達共同完成促進細胞凋亡作用［16］。從Western blot 和免疫組化法實驗結果可以看出，延丹膠囊能明顯降低p53 和Bax 蛋白的表達，而顯著提高Nrf2、HO?1和Bcl?2 蛋白的表達。即延丹膠囊可以通過改善氧化應激水平，發揮抗凋亡作用，從而對異丙腎上腺素致大鼠急性心肌缺血損傷具有改善作用。

綜上所述，延丹膠囊對異丙腎上腺素致大鼠急性心肌缺血損傷具有良好的保護作用，其作用機制可能與抗氧化，抗炎，改善細胞凋亡等因素相關。但其作用機制復雜，有待后續進一步研究。