不同產(chǎn)地薏苡仁HPLC 指紋圖譜建立及甘油三油酸酯測定

張 婷羅云云杜偉鋒*葛衛(wèi)紅李昌煜

（1.杭州市西溪醫(yī)院，浙江 杭州310023； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制技術(shù)研究中心，浙江杭州311401；3.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州310052； 4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，浙江 杭州310053）

薏苡仁為禾本科植物薏苡Coix lacrma?jobiL.var.mayuen（Roman.）Stapf 的干燥成熟種仁［1］，性涼，味甘淡，歸脾、肺、胃經(jīng)，具有健脾滲濕、清熱排膿、除弊、利水等功效［2?3］。其主要成分有甘油三酯類、多糖類、氨基酸及生物堿類等［4］。現(xiàn)代研究表明，薏苡仁可應(yīng)用于消化系統(tǒng)腫瘤［5］、胃腸功能紊亂［6］、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［7］等。薏苡仁為藥食同用的品種［8］，市場需求量大。在各地均有生長分布，以貴州、福建等為主產(chǎn)地。由于各產(chǎn)區(qū)種植方法和氣候條件的不同，造成其成分質(zhì)量差異［9］，從而導(dǎo)致薏苡仁臨床療效的差異，因此對不同產(chǎn)地薏苡仁質(zhì)量進(jìn)行更全面的評價(jià)，以期有利于優(yōu)化產(chǎn)地，保證相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量。

目前，中藥HPLC 指紋圖譜用于分析中藥有效成分的種類和含量，符合中醫(yī)中藥整體性和模糊性的特點(diǎn)，已逐漸應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制和評價(jià)中［10?12］。為了仔細(xì)分析不同產(chǎn)地薏苡仁的質(zhì)量差異，本研究對4 個主要產(chǎn)地（貴州、福建、浙江、云南）11 批薏苡仁進(jìn)行指紋圖譜相似度評價(jià)及聚類分析，同時檢測其指標(biāo)成分甘油三油酸酯的含量，比較樣品質(zhì)量差異，以期為薏苡仁最優(yōu)產(chǎn)地的選擇提供依據(jù)。另外，為更準(zhǔn)確反應(yīng)產(chǎn)地真實(shí)情況，實(shí)驗(yàn)樣品均為實(shí)地調(diào)研采樣所得，經(jīng)統(tǒng)一的加工方法處理。

1 材料

戴安3000 高效液相色譜儀（美國Dionex 公司）；LNN ELSD 3000 型蒸發(fā)光散射檢測器（美國LNN 公司）；DFT?200 手提式高速中藥粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；Al?204 型電子分析天平（瑞士梅特勒?托利多公司）。乙腈、二氯甲烷均為色譜純；水為娃哈哈純凈水。甘油三油酸酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度99.8%，批號111692?201605）。

本研究共選取了貴州、福建、浙江、云南出產(chǎn)的薏苡仁共11 批樣品，信息見表1，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)葛衛(wèi)紅教授鑒定均為正品。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 安捷倫反相C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈?二氯甲烷（65 ∶35）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃。蒸發(fā)光散射檢測器檢測［13］；載氣體積流量2.0 L／min；漂移管溫度70 ℃；保留時間50 min；增益2。

2.2 供試品溶液制備 取薏苡仁粉末（過3 號篩）約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入流動相50 mL，稱定質(zhì)量，浸泡2 h，超聲（300 W、50 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用流動相補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液制備 取甘油三油酸酯對照品適量，精密稱定，加流動相制備成每1 mL 含0.14 mg該成分的溶液，即得。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，將所得指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A 版”軟件，計(jì)算相似度均大于0.995，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一薏苡仁供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h 時進(jìn)樣，記錄指紋圖譜，所得圖譜導(dǎo)入軟件計(jì)算得相似度均大于0.995，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批薏苡仁粉末，精密稱定6 份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄指紋圖譜，導(dǎo)入指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件，計(jì)算相似度均大于0.995，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜分析

2.5.1 指紋圖譜建立 分別取不同產(chǎn)地薏苡仁S1～S11，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，得到各批薏苡仁HPLC 色譜圖，將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A 版”，其中保留時間穩(wěn)定的共有峰有7 個，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，將薏苡仁指紋圖譜與對照品色譜進(jìn)行比較，指認(rèn)出6 號鋒主要指標(biāo)成分甘油三油酸酯，將其作為參照峰，計(jì)算各共有峰與參比峰的峰面積比值，每個樣品的非共有峰面積占總峰面積的比值均小于20%，符合指紋圖譜要求。其中指紋圖譜疊加圖見圖1，對照品及薏苡仁樣品的共有峰模式圖見圖2～3。

圖1 11 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of eleven batches of samples

圖2 對照品HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of reference substance

圖3 樣品共有峰模式圖Fig.3 Common peak pattern of samples

2.5.2 相似度評價(jià)及聚類分析 分別將11 批樣品的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A）軟件，考察色譜峰相似度的一致性，進(jìn)行相似度評價(jià)，結(jié)果見表2，表明不同產(chǎn)地11 批樣品指紋圖譜中主要峰群的整體圖貌基本一致，雖然不同產(chǎn)地樣品中各成分含量有較大差別，但特征指紋峰的相對保留時間一致。11 批樣品中，除S3樣品相似度為0.705 外，其余相似度均大于0.902。不同產(chǎn)地樣品指紋圖譜沒有顯著性差異，其共有峰相對保留時間基本一致，峰面積比值存在較大差異，表明不同產(chǎn)地樣品質(zhì)量之間存在差異。

表2 11 批樣品相似度Tab.2 Similarities of eleven batches of samples

同時以篩選所得的7 個共有峰面積為變量，產(chǎn)地為自變量，應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4，表明11 批樣品分為3 類，Ⅰ類為S1、S2、S3、S5、S9、S10、S11，即貴州樣品、1 批福建樣品、1 批浙江樣品及云南樣品聚為一類；Ⅱ類為S4、S6、S8，即2 批福建樣品與1 批浙江樣品聚為一類；Ⅲ類為S7，即1 批浙江縉云縣的樣品單獨(dú)為一類。可見貴州和云南的樣品較為穩(wěn)定；而3 批浙江的樣品聚為3 類，2 批福建樣品聚為2類，可見即使同一產(chǎn)地，不同種植戶間的藥材質(zhì)量也有較大差異。

圖4 11 批樣品聚類分析樹狀圖Fig.4 Dendrogram of eleven batches of samples

2.6 甘油三油酸酯含量測定

2.6.1 線性關(guān)系考察 取甘油三油酸酯對照品逐級稀釋成5 個不同質(zhì)量濃度梯度對照品溶液，搖勻，同時在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以對照品質(zhì)量濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)（X），峰面積對數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝1.841 5X＋7.141 9（r＝0.999 3），在0.223～8.625 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.2 精密度試驗(yàn) 精密稱定甘油三油酸酯對照品適量，加入流動相制備成每1 mL 含0.25 mg 的對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測得峰面積、保留時間RSD 分別為2.41%、0.25%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 各進(jìn)樣1次，測得峰面積、保留時間RSD 分別為1.42%、0.57%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測得峰面積、保留時間RSD 分別為2.49%、0.51%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批樣品6 份，按低、中、高比例（0.5、1.0、2.0 倍）加入對照品甘油三油酸酯，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄各峰面積和保留時間，測得甘油三油酸酯平均加樣回收率為99.84%，RSD 為1.09%。

2.6.6 樣品含量測定 按“2.2”項(xiàng)下方法制備11 批供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL，根據(jù)外標(biāo)法［14］計(jì)算各組分含量，結(jié)果見表3。除S4 樣品的含量低于2020 年版《中國藥典》限度值0.50% 外，其余樣品均高于此限度值，其中S1 樣品最高，達(dá)0.998%；產(chǎn)自云南曲靖師宗縣的含量平均值最高，達(dá)0.911%；福建產(chǎn)樣品質(zhì)量穩(wěn)定性最差，RSD 為31.37%，而浙江、云南產(chǎn)樣品RSD 相對較低，質(zhì)量較為穩(wěn)定。

表3 甘油三油酸酯含量測定結(jié)果（%， n＝3）Tab.3 Results of content determination of glycerol trioleate（%， n＝3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對色譜條件進(jìn)行了系統(tǒng)性考察，包括乙腈?二氯甲烷流動相的不同比例（70 ∶30、68 ∶32、65 ∶35、62 ∶38、60 ∶40）、不同體積流量（0.5、0.8、1.0、1.3、1.5 mL／min）、不 同柱溫（20、25、30、35 ℃），最終確定“2.1”項(xiàng)下色譜條件。采用HPLC?ELSD 法測定薏苡仁指紋圖譜的同時獲得甘油三油酸酯含量，該方法穩(wěn)定可靠、重現(xiàn)性較高，可用于評價(jià)薏苡仁及其他含有甘油三油酸酯的藥材的質(zhì)量。而運(yùn)用指紋圖譜結(jié)合相似度分析和聚類分析，以及以甘油三油酸酯的含量作為指標(biāo)，可對不同產(chǎn)地薏苡仁的質(zhì)量進(jìn)行更為全面的評價(jià)。

結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的薏苡仁質(zhì)量存在差異，甚至來自同一省同一地區(qū)的樣本之間含量也有一定差異。大部分薏苡仁種植戶都是自己留種，在各地種植方法和氣候條件的影響下，經(jīng)過多年的人工種植，形成了一些各自不同的特征，可以解釋薏苡仁中化學(xué)成分的差異。同時，實(shí)地采樣調(diào)研發(fā)現(xiàn)福建薏苡產(chǎn)地加工方式差異較大，浦城產(chǎn)薏苡常供藥用，而食用型薏苡常加工成碎米，這可能是導(dǎo)致福建產(chǎn)薏苡質(zhì)量不穩(wěn)定的原因。因此，為能更好確保中藥的質(zhì)量，在建立完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的同時，還應(yīng)建立中藥材質(zhì)量追溯系統(tǒng)，實(shí)時監(jiān)控藥材從種植到臨床應(yīng)用的全過程，從而確保中藥療效。