UPLC 法比較黃芩不同炮制品中5 種黃酮類成分

羅 蘭魏劭恒張 英吳孟華曹 暉馬志國(guó)*

（1.中山大學(xué)新華學(xué)院藥學(xué)院，廣東 廣州510520； 2.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州510632； 3.暨南大學(xué)嶺南傳統(tǒng)中藥研究中心，廣東 廣州510632）

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi.的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效［1］。黃芩臨床應(yīng)用廣泛，炮制規(guī)格較多，除生品外，酒黃芩和黃芩炭是常用的2 種飲片規(guī)格。清熱瀉火解毒多用生品、清上焦肺熱多用酒炙品、清熱止血多用炭品［2?3］。以黃芩苷為代表的黃酮類是黃芩的主要活性成分［4?5］，黃芩不同炮制品黃酮類成分的比較研究雖有研究報(bào)道，但主要是采 用HPLC 指紋圖 譜［6?7］或多成 分定量的方法［8?12］，或采用LC?MS 法對(duì)成分進(jìn)行定性定量分析［6，13］，且多是生品與酒黃芩或黃芩炭2 種炮制品之間的比較。UPLC 法因具有更高的分離度和更快的分析速度，在黃芩藥材中已有應(yīng)用［14?15］，但未見采用UPLC 法對(duì)黃芩3 種飲片中5 種黃酮類成分（黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素和野黃芩苷）進(jìn)行對(duì)比研究的報(bào)道。本研究采用UPLC 法比較黃芩生品、酒黃芩、黃芩炭中5 種黃酮類成分的含量變化，以期為黃芩及其炮制品質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，為黃芩炮制原理的闡釋提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

Agilent 1290 超高效液相色譜儀［四元超高壓梯度泵、光電二級(jí)管陣列檢測(cè)器（DAD）、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、Agilent Chemstation 工作站，美國(guó)安捷倫公司］；ALC?110.4 電子分析天平（萬(wàn)分之一，德國(guó)賽多利斯公司）；AX223ZH 電子天平（美國(guó)奧豪斯公司）；KQ5200E 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；多功能粉碎機(jī)（永康市綠可食品機(jī)械有限公司）。

黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)110?715?201016，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；黃芩素（批號(hào)H?018?170426）、漢黃芩苷（批號(hào)H?019?161221）、漢黃芩素（批號(hào)H?029?171216）、野黃芩苷（批號(hào)Y?012?170825）對(duì)照品均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司。乙腈、甲酸（色譜純，上海晶純?cè)噭┯邢薰荆黄渌噭┚鶠榉治黾儯凰疄榧儍羲ㄈA潤(rùn)怡寶食品飲料有限公司）。

黃芩飲片（生品）3 批，分別購(gòu)自廣州二天堂大藥房（批號(hào)180501541）、廣州老百姓大藥房（批號(hào)180309）、廣州林和藥業(yè)（批號(hào)180528），經(jīng)暨南大學(xué)嶺南傳統(tǒng)中藥研究中心馬志國(guó)教授鑒定為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi.干燥根的炮制品。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制品制備

2.1.1 酒黃芩 參照2020 年版《中國(guó)藥典》 一部黃芩項(xiàng)下的酒黃芩炮制方法，取3 批黃芩飲片生品各約100 g，分別加黃酒10 mL，拌勻，悶透，置炒鍋中，用文火炒至深黃色，取出，放涼，備用。

2.1.2 黃芩炭制備 參照2020 年版《中國(guó)藥典》一部附錄“0213 炮制通則”中的炒炭法，取3 批黃芩飲片生品各約100 g，分別置熱鍋內(nèi)，用武火炒至黑褐色，噴淋清水少許，熄滅火星，取出，晾干，備用。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對(duì)照品適量，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度 分別為0.110、0.278、0.119、0.125、0.115 mg／mL 的貯備液，分別精密吸取0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 將生黃芩、酒黃芩、黃芩炭飲片分別粉碎過(guò)4 號(hào)篩，各取約0.3 g，精密稱定，置于100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入70% 乙醇40 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，取出，放冷，70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液1 mL 置10 mL 量瓶中，70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）?0.5%甲酸（B），梯度洗脫（0～20 min，20%～50% A；20～21 min，50%～90%A）；體積流量0.3 mL／min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量1 μL。在該色譜條件下，5 種成分理論板數(shù)均大于10 000，分離度均大于1.5，色譜圖見圖1。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣1 μL。以各對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6 次，每次1 μL，測(cè)得野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的峰面積RSD 分別為0.56%、0.69%、0.55%、0.69%、0.64%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、6、8、12、16 h 進(jìn)樣，每次1 μL，測(cè)得野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積RSD分別為0.72%、0.26%、0.29%、0.65%、0.94%，表明供試品溶液在16 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取生品粉末6 份，每份約0.3 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素含量RSD 分別為 1.23%、1.20%、1.15%、1.15%、1.05%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取“2.7”項(xiàng)下含量已知的生品粉末5 份，每份約0.15 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對(duì)照品溶液各5.0 mL，黃芩苷對(duì)照品溶液10 mL，70%乙醇補(bǔ)足至40 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝5）

2.9 樣品含量測(cè)定 分別取生黃芩、酒黃芩和黃芩炭樣品粉末各3 批，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量。結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g，， n＝3）Tab.3 Results of content determination for various con?stituents（mg／g，， n＝3）

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g，， n＝3）Tab.3 Results of content determination for various con?stituents（mg／g，， n＝3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用DAD 全波長(zhǎng)掃描對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行考察，結(jié)果表明5 種成分均在280 nm 處有最大吸收，故選擇280 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。此外，比較了乙腈?0.1%甲酸和乙腈?0.5%甲酸，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸作為流動(dòng)相時(shí)不僅出峰晚，且存在拖尾現(xiàn)象，而0.5%甲酸分離度高，在此基礎(chǔ)上，對(duì)梯度洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化。綜合考慮色譜峰的出峰時(shí)間、分離度、峰型，最終選擇“2.3”項(xiàng)下色譜條件。

本研究結(jié)果顯示，黃芩生品酒炙后5 種黃酮類成分總量下降了3.9%，其中野黃芩苷、黃芩苷和漢黃芩苷含量分別降低了13.3%、6.5%、12.2%，而黃芩素和漢黃芩素含量分別增加了102.8%、114.2%。與生品相比，黃芩炭中5 種黃酮類成分總量下降了67.8%，其中野黃芩苷含量極低，已無(wú)法檢測(cè)到；黃芩苷和漢黃芩苷含量分別降低了88.9%、89.9%，而黃芩素和漢黃芩素含量分別增加了444.2%、750.0%。黃芩苷與黃芩素、漢黃芩苷與漢黃芩素互為黃酮苷與苷元，表明酒炙、炒炭等加熱炮制方法，均會(huì)造成黃芩中黃酮類成分總量減少，且黃酮苷類成分會(huì)發(fā)生部分分解生成相應(yīng)的苷元，這種變化與炮制程度呈正相關(guān)。因酒炙采用文火加熱，溫度低，對(duì)黃酮類成分影響程度較低；而炒炭為武火加熱，溫度高，黃酮苷類成分大部分被破壞，或分解為苷元，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致［8，16?18］。此外，圖1 中黃芩炭色譜圖中16.5 min處出現(xiàn)一新的色譜峰，通過(guò)與文獻(xiàn) ［8］ 對(duì)比，此成分可能為千層紙素A，其轉(zhuǎn)化生成路徑及結(jié)構(gòu)還有待于進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，黃芩炮制后，黃酮類成分的含量與相對(duì)比例均發(fā)生了明顯變化，這與黃芩不同炮制品間功效的差異密切相關(guān)。生黃芩，味苦、性寒，所含5 種黃酮類成分總量最高，且以黃芩苷為主，長(zhǎng)于清熱瀉火。黃芩酒炙后，總黃酮含量略有減少，且酒性大熱，從而緩和了苦寒之性，用于上焦肺熱及四肢膚表之濕熱。黃芩炒炭后，總黃酮含量大大降低，苦寒之性大減，但黃芩素、漢黃芩素等苷元含量及在總黃酮中所占比例均明顯增加，以清熱止血為主，但黃芩炭止血作用是否與黃芩素、漢黃芩素等黃酮苷元有關(guān)，尚有待于進(jìn)一步研究。