基于多元統計分析和多指標評價假東風草和東風草的質量

蘇宏娜李學學農常東李修善李文兵劉 圓

（1.西南民族大學藥學院，四川 成都610041； 2.四川省羌彝藥用資源保護與利用技術工程實驗室，四川成都610225； 3.西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都610041； 4.西南民族大學民族醫藥研究院，四川 成都610041； 5.廣西萬壽堂藥業有限公司，廣西 南寧530000）

滇桂艾納香為廣西壯瑤彝傳統使用藥材，具有活絡經血、祛風除濕、止血、利尿等功效，用于治療經期不準、產后大出血、不孕癥、陰瘡、風濕骨痛等癥［1?3］，在廣西尤其是在百色地區有較長的使用歷史。研究發現［4?7］滇桂艾納香主要含有黃酮類、甾醇類、多糖類及水溶性活性成分等。藥理實驗證明［4?5，8?10］，滇桂艾納香有增強子宮收縮、促凝血、鎮痛、抗炎、保護肝臟等作用。

廣西省藥材標準、湖南省中藥材標準［11］僅收載假東風草Blumea riparia（Bl.）DC.作為滇桂艾納香藥材來源。但課題組前期文獻［1，3，12?13］考證和實地走訪調研、多次采集原植物花期、果期發現，滇桂艾納香藥材在壯瑤醫臨床使用、壯瑤草藥材市場有“小花種”“大花種”2 種，制藥企業生產中滇桂艾納香生產投料中的假東風草Blumea riparia（Bl.）DC.（小花種，地標收載品種）。課題組開展了進行原植物鑒別，確定“小花種”為菊科艾納香屬植物假東風草的干燥全草，又名滇桂艾納香［1］；大花種為菊科艾納香屬植物東風草Blumea megacephala（Randeria）Chang et Tseng 的干燥全草，又名白花九里明、管芽［3］等，對風濕骨痛、跌打腫痛、產后血崩、月經不調有一定的療效［14?15］。目前，國內對東風草（大花種，非標品種）是否能作為滇桂艾納香藥材來源等同入藥的相關研究較少［13?14］。因此，本研究擬對東風草與假東風草開展藥材質量比較，結合課題組其他研究結果，為確認東風草是否能夠納入滇桂艾納香的一個新的植物基原同等入藥提供參考。

1 材料

LC?7030C 3D 高效液相色譜儀（日本島津公司）；TU?1810 型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；KQ?259DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AE240 電子分析天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；DHG?9240A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；SX2 型箱式電阻爐（長沙市遠東電爐廠）；HH?2 型數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

蘆丁對照品（批號100080?200707，純度≥98%）購于中國食品藥品檢定研究院；3，4?二咖啡酰奎寧酸（批號17121201）、3，5?二咖啡酰奎寧酸（批號19061201）對照品均購自成都普菲德生物技術有限公司，純度均大于98%。乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，北京迪馬科技有限公司）；甲醇、鹽酸、乙醇（分析純，成都市科隆化學品有限公司）；水為屈臣氏蒸餾水。藥材由課題組采自廣西省百色市、南寧市，經西南民族大學劉圓教授、李瑩副教授鑒定為菊科艾納香屬植物假東風草Blumea riparia（Bl.）DC.（小花種，地標收載品種）、菊科艾納香屬植物東風草Blumea megacephala（Randeria）Chang et Tseng（大花種，非標品種），信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 水分、總灰分、酸不溶性灰分測定 按2020年版《中國藥典》 四部［15］方法，對水分（通則0832）、總灰分（通則2302）、酸不溶性灰分（通則2302）進行測定。

2.2 醇溶性浸出物測定 以40%乙醇為溶劑，按2020 年版《中國藥典》 四部［15］（通則2201）醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法測定。

2.3 總黃酮含量 參考文獻［16］ 中響應面優化的條件、方法，測定樣品中總黃酮含量。

2.3.1 對照品溶液制備 取蘆丁對照品適量，精密稱定質量，40%乙醇定容至10 mL，搖勻，得質量濃度為1 mg／mL 的母液。分別精密量取0、0.1、0.2、0.5、0.8、1 mL，加0.3 mL 5% NaNO2溶液，混勻，靜置6 min，加0.3 mL 10% Al（NO3）2混勻，靜置6 min，再加4 mL NaOH 試液，40%乙醇稀釋至10 mL，搖勻，制成質量濃度為0.01、0.02、0.05、0.08、0.1 mg／mL 的對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液制備 取待測樣品0.2 g，精密稱定質量，置于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 40%乙醇，密塞，稱定質量，超聲（600 W、40 kHz）處理30 min，放冷，40% 乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精確量取0.1 mL 濾液，加0.3 mL 5%NaNO2溶液，混勻，靜置6 min，加0.3 mL 10%Al（NO3）2混勻，靜置6 min，再加4 mL NaOH 試液，40%乙醇稀釋至10 mL，搖勻，即得。

2.3.3 線性關系考察 取對照品溶液，在500 nm波長下測定吸光度。以質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝12.184X－0.017 6（r＝0.999 8），在10～100 μg／mL范圍內線性關系良好。

2.3.4 精密度試驗 取適量“2.3.1”項下對照品溶液，連續測定6 次吸光度。結果，吸光度RSD為0.86%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復性試驗 取同一批樣品（D10）6 份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，測定吸光度。結果，吸光度RSD 為1.43%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 穩定性試驗 取“2.3.2”項下對照品溶液，分別在0、10、20、40、60 min 測定吸光度。結果，吸光度RSD 為0.91%，表明供試品溶液于制備后1 h 內穩定性良好。

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相［乙腈?甲醇（1 ∶1）］ ?0.1% 甲 酸；體積流 量1.0 mL／min；檢測波 長327 nm；柱溫30 ℃。3，4?二咖啡酰奎寧酸、3，5?二咖啡酰奎寧酸與樣品中其他組分色譜峰達基線分離，其理論塔板數均大于5 000，見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 對照品溶液制備 取3，4?二咖啡酰奎寧酸、3，5?二咖啡酰奎寧酸對照品適量，精密稱定質量，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇溶解并稀釋至刻度（質量濃度分別為1.028、0.992 mg／mL），70%甲醇稀釋，得到3，4?二咖啡酰奎寧酸質量濃度分別為0.010 0、0.020 1、0.051 4、0.082 2、0.102 8 mg／mL，3，5?二咖啡 酰奎寧 酸質量 濃度分別為0.001 0、0.019 8、0.049 6、0.079 4、0.099 2 mg／mL的對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液制備 取樣品約0.2 g，精密稱定質量，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 70%甲醇，密塞，稱定質量，超聲（600 W、40 kHz）處理30 min，放冷，70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4.4 線性關系考察 準確吸取適量對照品溶液，70%甲醇稀釋成不同質量濃度，在“2.4.1”項色譜條件下進樣。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表2，表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.5 精密度試驗 取適量“2.4.2”項下對照品溶液，在“2.4.1”項色譜下連續進樣6 次。結果，3，4?二咖啡酰奎寧酸、3，5?二咖啡酰奎寧酸峰面積RSD 分別為0.56%、0.52%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 重復性試驗 取同一批樣品（D10）6 份，按“2.4.3”項下方 法制備 供試品溶液，在“2.4.1”項色譜條件下測定，測得3，4?二咖啡酰奎寧酸含量RSD 為1.67%，3，5?二咖啡酰奎寧酸含量RSD 為1.93%，表明該方法重復性良好。

2.4.7 穩定性試驗 取“2.4.2”項下對照品溶液，于0、6、12、18、24 h 在“2.4.1”項色譜條件下進樣，測得3，4?二咖啡酰奎寧酸、3，5?二咖啡酰奎寧酸含量RSD 分別為0.52%、0.49%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗 取同一批樣品（D12），按“2.4.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按1 ∶1 的比例加入3，4?二咖啡酰奎寧酸、3，5?二咖啡酰奎寧酸，測得兩者平均加樣回收率分別為101.63%、99.23%，RSD 分別為3.82%、2.01%。

3 結果與分析

3.1 測定結果 由表3 可知，9 批假東風草水分含量最高為9.98%，最低為7.83%，平均值為9.21%，均符合2009 年版 《湖南省中藥材標準》［17］不得超過14.0%的規定；9 批假東風草總灰分含量最高為8.88%，最低為4.94%，平均值為6.50%；酸不溶性灰分含量最高為1.23%，最低為0.57%，平均值為0.87%；浸出物含量最高為27.08%，最低為17.61%，平均值為22.21%。10批東風草水分含量最高為9.67%，最低為6.24%，平均值為8.00%；總灰分含量最高為10.68%，最低為6.52%，平均值為8.90%；酸不溶性灰分含量最高為1.73%，最低為0.79%，平均值為1.21%；浸出物含量最高為17.77%，最低為10.57%，平均值為13.56%。

表3 假東風草和東風草測定結果Tab.3 Determination results of B.riparia and B.megacephala

9 批假東風草總黃酮平均含量為126.10 mg／g，10 批東風草其平均含量為82.65 mg／g。9 批假東風草中3，4?二咖啡酰奎寧酸、3，5?二咖啡酰奎寧酸平均含量分別為7.80、4.18 mg／g，10 批東風草兩者平均含量分別為3.52、4.43 mg／g。

3.2 聚類分析 采用SPSS 20.0 軟件對9 批假東風草和10 批東風草水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、總黃酮、3，4?二咖啡酰奎寧酸、3，5?二咖啡酰奎寧酸含量測定結果進行系統聚類分析，結果見圖2。由此可知，以水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、總黃酮、3，4?二咖啡酰奎寧酸和3，5?二咖啡酰奎寧酸為指標，可將假東風草和東風草聚為兩類，其中D2～D3、D7～D8、D10～D14、D16～D19 聚為一 類，D1、D4～D6、D9、D15 聚為另一類，但未能將2 個物種明顯區分開。

圖2 9 批假東風草、10 批東風草樹狀圖Fig.2 Dendrogram of nine batches of B.riparia and ten batches of B.megacephala

3.3 主成分分析 采用SPSS 20.0 軟件對9 批假東風草和10 批東風草水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、總黃酮、3，4?二咖啡酰奎寧酸、3，5?二咖啡酰奎寧酸含量測定結果進行主成分分析，結果見圖3。以特征值（n）≥1 為原則提取2 個主成分，累積貢獻率達到71.93%，可說明7 種成分的變化趨勢，從而客觀反映假東風草和東風草信息。浸出物、總黃酮和3，5?二咖啡酰奎寧酸在第1 主成分中有較高載荷，可反映這3 種成分的信息，呈高度正相關；3，4?二咖啡酰奎寧酸在第2主成分中有較高載荷，可反映這1 種成分的信息，呈高度正相關。根據提取的2 種主成分得分對19批樣品進行分析，發現可將D5、D9、D12、D14、D16、D18～D19 分為一 類，D1～D4、D6～D8、D10～D11、D13、D17 分為另一類，但也未能將假東風草、東風草2 個品種明顯區分開，與聚類分析結果基本一致。

圖3 24 批樣品主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis plot for twenty?four batches of samples

4 討論與結論

9 批假東風草和10 批東風草水分、灰分和浸出物含量最高值與最低值之間有較大差異，表明不同產地假東風草和東風草種間和種內質量均有差異；假東風草總黃酮含量高于東風草；假東風草中3，4?二咖啡酰奎寧酸的含量高于3，5?二咖啡酰奎寧酸，且3，4?二咖啡酰奎寧酸含量高于東風草；東風草中3，5?二咖啡酰奎寧酸含量高于3，4?二咖啡酰奎寧酸，且高于假東風草中3，5?二咖啡酰奎寧酸含量。多指標系統聚類分析和主成分分析結果并未將東風草和假東風草2 個品種明顯區分開。

3，4?二咖啡酰奎寧酸和3，5?二咖啡酰奎寧酸是一類廣泛存在于金銀花、蒼耳等中藥材中的二咖啡酰奎寧酸類［17?18］。據文獻報道［17?20］，該類成分具有抗氧化、抗炎、抗血小板活性物質等作用；課題組前期針對這2 種植物的化學成分分離研究中，提取分離出3，4?二咖啡酰奎寧酸和3，5?二咖啡酰奎寧酸，故選用該2 種成分與藥材功效相關且在植物中含量較高、容易得到的成分作為質量指標性成分。

根據本實驗結果，基于東風草的總黃酮、3，4?二咖啡酰奎寧酸、3，5?二咖啡酰奎寧酸含量較高，藥材市場、廣西百色市和南寧市壯瑤彝等民族民間臨床長期混用、新資源發現的實際情況，結合課題組其他研究結果綜合考慮，建議對東風草與假東風草開展臨床功效對應的藥效學比較研究，將東風草納入滇桂艾納香的一個新的植物基原同等入藥；滇桂艾納香藥材項下，規定水分不超過14%，總灰分不超過11.00%，酸不溶性灰分不超過1.50%，浸出物不低于11.00%，總黃酮含量不低于67.00 mg／g，3，4?二咖啡酰奎寧酸含量不低于2.80 mg／g，3，5?二咖啡 酰奎寧 酸含量不低于3.50 mg／g。