二巖虎果無糖顆粒HPLC 指紋圖譜的建立

楊 宏劉永琴徐昌艷羅忠圣錢志瑤覃容貴*

（1.貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽550025； 2.貴州醫科大學天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽550014；3.貴州醫科大學 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽550025； 4.貴州醫科大學公共衛生學院，貴州 貴陽550025）

二巖虎果湯為貴州醫科大學附屬醫院名老中醫饒天培的經驗方，由石吊蘭、巖白菜、虎杖、石仙桃4 味藥材組成，主治風熱內蘊、痰熱犯肺所致咳嗽、哮喘，臨床效果顯著，應用多年未見不良反應，課題組計劃將其開發為醫院制劑，前期已完成拆方［1］、無糖顆粒制備工藝、部分質量標準［2］的研究。文獻報道，二巖虎果湯君藥石吊蘭中石吊蘭素［3］、臣藥巖白菜中巖白菜素［4?5］、佐藥虎杖中虎杖苷［6］和大黃素［7］等均為鎮咳、抗炎有效成分，也是影響無糖顆粒藥效的重要因素?；瘜W識別模式包括主成分分析［8］、聚類分析［9］、偏最小二乘法判別分析［10?11］、灰色關聯度分析［12］等方法，可對藥物不同層面的信息進行深入分析［13］。本實驗將建立二巖虎果無糖顆粒HPLC 指紋圖譜，以期較全面地反映該制劑質量。

1 材料

1.1 藥材 石吊蘭、巖白菜、虎杖、石仙桃均購于貴州省萬東橋藥材市場，經貴州醫科大學覃容貴教授鑒定為正品。經檢驗，石吊蘭、巖白菜、虎杖質量均符合2015 年版《中國藥典》 規定，石仙桃質量符合2003 年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》 規定。

1.2 顆粒 稱取等份各藥材，加入適量蒸餾水回流提取3次，合并提取液后濃縮，加入95%乙醇，4 ℃下放置24 h，棄去沉淀，醇沉液回收乙醇至無醇味，低溫烘干后粉碎，得干膏粉。干膏粉、糊精、可溶性淀粉以1 ∶1.8 ∶0.2 的比例加80%乙醇制粒，烘干，整粒，即得二巖虎果無糖顆粒，其呈棕黃色至棕褐色，氣香，味微苦，以鋁塑復合袋分裝，每袋裝15 g，編號為S1（批號20180912）、S2（批號 20190311 ）、S3（批 號 20190201 ）、S4（批 號20190125）、S5（批號20190321）、S6（批號20190401）、S7（批號20190221）、S8（批 號20190412）、S9（批 號20181020）、S10（批號20180212）。

1.3 試劑 石吊蘭素（批號111555?200602）、巖白菜素（批號111532?201604）、虎杖苷（批號111575?201603）、大黃素（批號110756?200110）對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供。色譜純甲醇（美國Tedia 公司）；分析純甲醇（國藥集團化學試劑有限公司）；水為純凈水（深圳娃哈哈榮泰實業有限公司）。

1.4 儀器 ULtiMate 3000 型高效液相色譜儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；BT?25S 型電子天平（十萬分之一，德國Sartorius 公司）；AS5051B 型超聲波清洗儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters X?select C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）?水（B），梯度洗脫（0～10 min，10% A；10～20 min，10%～27% A；20～80 min，27%～70% A；80～90 min，70% A；90～100 min，70%～100%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長304 nm；進樣量20 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取石吊蘭素、巖白菜素、虎杖苷、大黃素對照品適量，加70%甲醇制成每1 mL 分別含四者0.025、0.35、0.048、0.015 mg 的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取顆粒適量，研細，取細粉約1.0 g，精密稱定，置于100 mL 錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷至室溫，70%甲醇補足減失的質量，混勻，溶液過0.45 μm 微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同1 份供試品溶液（S4），在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，以3 號峰（虎杖苷）為參照峰（S），測得各共有峰相對保留時間RSD 小于0.4%，相對峰面積RSD 小于3%，相似度大于0.998，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取同1 批顆粒（S4），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，以3 號峰（虎杖苷）為參照峰（S），測得各共有峰相對保留時間RSD 小于1%，相對峰面積RSD 小于3%，相似度大于0.998，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同1 份供試品溶液（S4），于0、2、4、6、8、12、24、48 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，以3 號峰（虎杖苷）為參照峰（S），測得各共有峰相對保留時間RSD 小于3%，相對峰面積RSD 小于3%，相似度大于0.995，表明供試品溶液在48 h 內穩定性良好。

2.5 HPLC 指紋圖譜建立

2.5.1 共有模式 取10 批樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，采用中藥指紋圖譜相似度評價系統（2012 版），以S4 樣品色譜圖為參照，時間窗寬度0.4 min，中位數法生成對照圖譜，多點矯正后作色譜峰匹配疊加，共確定15 個共有峰，指紋圖譜見圖1。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜

2.5.2 共有峰 與對照品保留時間和紫外光譜繼續比對后，指認了4 種成分，分別為3 號峰（巖白菜素）、5 號峰（虎杖苷）、12 號峰（石吊蘭素）、13 號峰（大黃素），其中虎杖苷色譜峰分離度較好，峰面積最大，峰型穩定，所有樣品均含有，故選擇其作為參照峰（S），色譜圖見圖2。

圖2 各成分HPLC 色譜圖

2.5.3 相似度 應用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）計算相似度，結果見表1，可知均大于0.900，表明各批樣品具有較高相似性。再統計各批樣品共有峰峰面積、相對保留時間及兩者RSD，結果見表2，可知其RSD在18.48%～68.12% 范圍內，表明各批樣品質量具有較大差異。

表1 10 批樣品相似度

表2 10 批樣品共有峰信息

2.6 化學模式識別

2.6.1 聚類分析 將10 批樣品共有峰峰面積導入SIMCA 14.1 軟件進行聚類分析，結果見圖3。由此可知，各批樣品可分為3 類，其中Ⅰ類包括S2、S3、S5、S6、S8、S10，Ⅱ類包括S4、S7，Ⅲ類包括S1、S9。

圖3 10 批樣品聚類分析圖

2.6.2 主成分分析 將10 批樣品共有峰峰面積導入SIMCA 14.1 軟件進行主成分分析，結果見表3，可知相關數據可降維成4 個主成分，其中前2 個貢獻率最大，累積可達93.9%，故以其為坐標軸構建組主成分平面，將樣品的多元變量通過降維方式投影在該平面上以觀察其整體分布情況，結果見圖4。由此可知，10 批樣品可分為3 類，其中Ⅰ類在一、四象限比較集中，Ⅱ類分布在第三象限，與Ⅰ類距離較近；Ⅲ類分布在第二象限，與其他樣品距離較遠，與“2.6.1”項下聚類分析結果一致。主成分分析載荷圖可表示每個色譜峰對主成分的綜合貢獻，通過測量色譜峰投影點到坐標軸原點的距離來表達該色譜峰對樣本分類的整體影響［14］，發現1 號、2 號、3 號（巖白菜素）、5 號（虎杖苷）、7 號、8 號、10 號、12 號（石吊蘭素）、13 號（大黃素）色譜峰的影響較大，見圖5。

圖4 10 批樣品主成分散點得分圖

圖5 10 批樣品主成分載荷圖

表3 主成分分析特征值及累積方差貢獻率

2.6.3 偏最小二乘法判別分析 將10 批樣品共有峰峰面積導入SIMCA 14.1 軟件進行有監督的偏最小二乘法判別分析（PLS?DA），結果見圖6，可知主成分回歸系數Q2為0.773，矩陣結實程度R2X為0.937，型區分參數R2Y為0.894，均大于0.5，表明該模型對樣品的區分程度和預測能力較強。變量重要性投影值（VIP）可反映色譜峰貢獻程度［14］，以VIP＞1 為標準，12 號（石吊蘭素）、7 號、3號（巖白菜素）、1 號、5 號（虎杖苷）、13 號（大黃素）色譜峰可能是導致不同批次樣品差異的主要標志物，見圖7，與“2.6.2”項下主成分分析載荷圖的重要性權重大體一致，取兩者交集后按VIP 值排序，依次為12 號（石吊蘭素）、7 號（未知化合物1）、3 號（巖白菜素）、1 號（未知化合物2）、5 號（虎杖苷）、13 號（大黃素）色譜峰，是3 種類型樣品之間產生差異的重要成分，提示僅測定石吊蘭素含量無法全面描述顆粒質量，在今后研究和生產中應重點關注上述6 種成分含量的變化。

圖6 10 批樣品PLS?DA 散點得分圖

圖7 10 批樣品色譜峰VIP 圖

3 討論與結論

本實驗考察了不同溶劑及比例（55%甲醇、70%甲醇、甲醇、55%乙醇、70% 乙醇、乙醇）、提取時間（15、30、45 min）的效果，發現70%甲醇超聲提取30 min 時色譜峰最多，峰型較好，能在較大程度上反應二巖虎果無糖顆粒成分信息。再采用DAD 檢測器采集190～400 nm 波長下的紫外色譜圖，通過觀察3D 圖譜選擇了215、304、335 nm，發現304 nm 下色譜峰響應良好，檢出數量最多，而且基線穩定，峰面積適中，故確定304 nm 作為檢測波長。

采用聚類分析、主成分分析、偏最小二乘法判別分析對10 批二巖虎果無糖顆粒HPLC 指紋圖譜進行化學模式識別，建立樣品分類模型。結果顯示，各批樣品HPLC 指紋圖譜形貌基本一致，但成分含量不盡相同，可能與藥材產地、炮制方法、采收季節、儲藏條件、生產規模等因素有關；所有樣品分為3 類；石吊蘭素、未知化合物1、巖白菜素、未知化合物2、虎杖苷、大黃素是主要差異標志物，可作為質量控制成分來綜合反映其質量的整體性和特征性。

綜上所述，本實驗建立了二巖虎果無糖顆粒HPLC 指紋圖譜，該方法靈敏度高，分離度好，信息豐富，特征性強，能全面系統的反映該制劑質量，以期為其深入研究開發提供參考依據。