化痰活血方通過IL?13 信號通路對哮喘小鼠肺組織MUC5AC 分泌的影響

魏義杰毛曉健傅榕冰伍林澤胡旭紅童曉云黃 豐*

（1.騰沖市中醫醫院，云南 騰沖679100； 2.云南中醫藥大學，云南 昆明650500； 3.云南中醫藥大學第一附屬醫院，云南 昆明650021）

支氣管哮喘是以氣道炎癥為代表的多種病理因素參與的慢性呼吸道疾病，最新報道顯示，我國患者已有4 750萬［1］，因此，相關工作的推進日益緊迫。正常人體也會分泌黏液，黏液作為固有免疫系統的第一道屏障，具有保護和濕潤氣道的作用，然而在某些病理狀態下，氣道粘液分泌異常是哮喘病死率居高不下的重要原因［2?3］。因此，藥物有效的干預其生成有積極地臨床意義。

化痰活血方由三子養親湯加桃紅四物湯組成，本課題組前期研究顯示，該方可抑制哮喘小鼠肺泡灌洗液中多種炎性因子的生成，并且能明顯抑制與黏蛋白MUC5AC 生成密切相關的IL?13 的生成［4?6］。因此，本實驗擬觀察化痰活血方調節哮喘小鼠肺組織IL?13／MUC5AC 通路中各分子的變化，探討其可能作用的分子機制。

1 材料

1.1 動物 Balb／c 雌性小鼠，6 周齡，購自長生生物技術股份有限公司，生產許可證號［SCXK（遼）2015?0001］。

1.2 儀器 超聲霧化儀（德國百瑞有限公司）；酶標儀［美谷分子儀器（上海）有限公司］；RT?qPCR 儀（美國羅氏公司）；離心機（德國海蒂斯公司）。

1.3 試劑 OVA（美國Sigma 公司，批號A5253，Grade II）；Al（OH）3（上海阿拉丁生化科技有限公司，批號38701）；地塞米松（美國Sigma 公司，批號D1756）；抗MUC5AC 抗體（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號E?AB?40037）；抗IL?13 抗體（批號bs?0560R）、抗IL?4Rα 抗體（批號bs?23579R）、抗GAB2 抗體（批號bs?2885R）、抗Phospho?GAB2 抗體（批號bs?3177R）、抗FOXA2 抗體（批號bs?2358R）（北京博奧森生物技術有限公司）；抗Phospho?IL?4Rα 抗體（批號PA5?38614）、抗Phospho?IL?13Rα1 抗體（批號PA5?38607）（美國Thermo Fisher 公司）；抗IL?13Rα1抗體（英國Abcam 公司，批號ab79277）；RNA 抽提液（武漢塞維爾生物技術有限公司，批號G3013）；cDNA 合成試劑盒（美國Thermo 公司，批號K1622）；熒光定量試劑盒（瑞士Roche 公司，批號04913914001）。

2 方法

2.1 分組、造模 小鼠隨機分為正常組、模型組、地塞米松組及化痰活血方高、中、低劑量組，造模及各給藥組小鼠腹腔注射3 次OVA 以致敏 ［第1、8、15 天，OVA 1 mg／mL，Al（OH）35 mg／mL］，0.2 mL／只；正常組予同體積生理鹽水注射。3 周后，連續1 周（30 min／次）2%OVA 霧化，正常組小鼠給予同體積生理鹽水處理。

2.2 給藥 于第21 天開始灌胃給藥，連續7 d。正常組、模型組均給予生理鹽水（0.1 mL／10 g），陽性藥物組給予地塞米松（1 mg／kg），化痰活血方高、中、低劑量組分別給予相應劑量化痰活血方（30、15、7.5 g／kg）。

2.3 取材 于實驗第28 天處死小鼠，取右中肺，石蠟包埋備用。

2.4 免疫組化法檢測相關蛋白的表達 取小鼠肺組織，分別加入“1.3”項下IL?13／MUC5AC 通路中各抗體，用圖像軟件進行比對，統計平均光密度值（IOD／Area）。

2.5 肺組織MUC5AC 基因定量分析 提取各小鼠肺組織Total RNA，進行熒光定量PCR檢測。引物分別為5′?GGACTTCAATATCCAGCTACGC?3′（正向）、5′?GGACT?TCAATATCCAGCTACGC?3′（反向），對照基因為GAPDH。

3 結果

3.1 對肺組織中MUC5AC 表達的影響 化痰活血方高、中、低劑量組均可抑制小鼠肺組織中MUC5AC 的表達（P＜0.01），見圖1。

圖1 化痰活血方對MUC5AC 表達的影響（IHC×400）

3.2 對肺組織中IL?13 表達的影響 化痰活血方高、中、低劑量組均可降低小鼠肺組織中IL?13 的表達（P＜0.05，P＜0.01），見圖2。

圖2 化痰活血方對IL?13 表達的影響（IHC×400）

3.3 對小鼠肺組織中IL?4Rα 表達的影響 化痰活血方高、中、低劑量組均可降低小鼠肺組織中IL?4Rα 的表達（P＜0.05，P＜0.01），見圖3。

圖3 化痰活血方對IL?4Rα 表達的影響（IHC×400）

3.4 對小鼠肺組織中P?IL?4Rα 表達的影響 化痰活血方高、中、低劑量組均可抑制小鼠肺組織中P?IL?4Rα 的表達（P＜0.01），見圖4。

圖4 化痰活血方對P?IL?4Rα 表達的影響（IHC×400）

3.5 對小鼠肺組織中IL?13Rα1 表達的影響 化痰活血方高、中、低劑量組均可抑制小鼠肺組織中IL?13Rα1 的表達（P＜0.01），見圖5。

圖5 化痰活血方對IL?13Rα1 表達的影響（IHC×400）

3.6 對小鼠肺組織中p?IL?13Rα1 表達的影響 化痰活血方高、中、低劑量組可降低小鼠肺組織中p?IL?13Rα1 的表達（P＜0.05，P＜0.01），見圖6。

圖6 化痰活血方對p?IL?13Rα1 表達的影響（IHC×400）

3.7 對小鼠肺組織中GAB2 表達的影響 化痰活血高、中、低劑量組均可抑制小鼠肺組織中GAB2 的表達（P＜0.01），見圖7。

圖7 化痰活血方對GAB2 表達的影響（IHC×400）

3.8 對小鼠肺組織中p?GAB2 表達的影響 化痰活血方高、中、低劑量組均可抑制小鼠肺組織中p?GAB2 的表達（P＜0.01），見圖8。

圖8 化痰活血方對p?GAB2 表達的影響（IHC×400）

3.9 對小鼠肺組織中FOXA2 表達的影響 化痰活血方高、中、低劑量組均可升高小鼠肺組織中MUC5AC 抑制子FOXA2 蛋白的表達（P＜0.01），見圖9。

圖9 化痰活血方對FOXA2 表達的影響（IHC×400）

3.10 各組小鼠肺組織MUC5AC基因的變化 化痰活血方高、中、低劑量組均可抑制小鼠肺組織中MUC5AC基因的表達（P＜0.01），見圖10。

圖10 化痰活血方對MUC5AC 基因表達的影響

4 討論

哮喘屬于中醫哮證范疇，《丹溪纂要·喘》 一書中提及“痰者凡喘，便有痰聲”，同時，臨床大量患者往往“久病入絡”。此外，痰瘀皆為津血化生，痰瘀常相互為患［4，7?8］。在此理論指導下，前期研究了化痰活血方防干預哮喘的多種機制，其可明顯抑制與黏蛋白生成密切相關的IL?13 上下游分子，為進一步闡釋其作用機制，本實驗從IL?13／MUC5AC通路入手，觀察化痰活血方對其中各個環節的作用。

MUC5AC 的異常分泌是哮喘患者臨床導致氣道阻塞的重要成分，并與哮喘氣道炎癥相關［9］。比如，IL?13 異常產生可導致氣道杯狀細胞化生（黏蛋白主要分泌細胞）［10］。Haj 等［11］人采用免疫組化檢測哮喘患者肺組織中MUC5AC和IL?13 的表達，發現其表達較高。從圖1～2 中可知，經化痰活血方干預后，MUC5AC 和IL?13 表達明顯下降，說明化痰活血方能明顯抑制哮喘狀態下MUC5AC 的生成，其作用途徑可能與IL?13 通路相關，因此，本實驗對通路上的各蛋白進行了檢測。

IL?13R 是由IL?4Rα 和IL?13Rα1 鏈共同組成的異源二聚體［12?13］，本實驗中采用免疫組化對哮喘小鼠肺組織中IL?13 受體IL?4Rα 和IL?13Rα1 表達水平進行檢測，實驗結果表明化痰活血方能夠顯著降低IL?4Rα 和IL?13Rα1 在哮喘小鼠肺組織中的表達，說明化痰活血方可以抑制二者的表達，可能存在抑制性成分抑制其受體（圖3、圖5）。同時，檢測了p?IL?4Rα 和p?IL?13Rα1（圖4、圖6），結果顯示，化痰活血方能明顯降低p?IL?4Rα 和p?IL?13Rα1 的表達。IL?13R 是氣道上皮細胞膜表面受體，在各種因子的刺激下，可激活并上調MUC5AC［14］。化痰活血方能抑制IL?13R的各蛋白磷酸及非磷酸化蛋白的表達，說明化痰活血方對杯狀細胞該通路的上游分子可能有抑制作用，繼而抑制MUC5AC 的分泌。

近年相關研究顯示，GAB2 的表達與MUC5AC 的分泌呈現正相關關系［15］。在炎癥因子的刺激下，IL?4Rα 與IL?13Rα1 可活化并形成異二聚體，接著活化絡氨酸蛋白激酶TYK2，進一步導致STAT6 磷酸化，然后下調MUC5AC 基因負反饋因子FOXA2 基因，從而上調MUC5AC 的基因表達［16?18］。哮喘氣道黏液分泌過程調節中，FOXA2 直接作用于氣道上皮細胞抑制MUC5AC 基因的轉錄，是多條調節黏液分泌信號通路的匯合點［19?20］。免疫組化法對哮喘小鼠GAB2、P?GAB2、FOXA2 蛋白檢測發現，化痰活血方能顯著降低哮喘小鼠肺組織中GAB2、p?GAB2 的表達（圖7～8），升高FOXA2 水平（圖9）。采用熒光定量PCR 結果顯示，化痰活血方能從基因水平抑制MUC5AC的表達（圖10）。

綜上所述，化痰活血方高劑量對IL?13 信號通路各蛋白及黏蛋白MUC5AC 的調控作用較強，中劑量次之，低劑量較次之，存在一定的濃度依賴性。化痰活血方可通過調節IL?13 信號通路來下調黏蛋白MUC5AC基因表達，繼而減少哮喘小鼠的黏液分泌情況，從而達到改善哮喘肺部病理情況。但化痰活血方針對IL?13 信號通路干預MUC5AC生成的機制研究需進一步深入研究，比如要借助基因干擾技術進一步明確其作用的特異靶點。