表沒食子兒茶素沒食子酸酯對H22 肝癌荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用

彭 靜陳 曦

（1.樂山職業技術學院中醫教研室，四川 樂山614000； 2.樂山市市中區人民醫院中醫科，四川 樂山614000）

表沒食子兒茶素沒食子酸酯是從綠茶中提取的多酚類化合物，具有干預代謝酶活性、保護心腦血管功能、調節免疫內分泌、降低氧化應激水平及抗腫瘤等多種生物學活性，得到人們越來越多的關注［1］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯的抗腫瘤作用被廣泛研究，其具有抗胃癌、肺癌及神經膠質瘤等作用［2?4］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯具有較高的體內抑瘤活性，能夠通過抗氧化作用抑制H22小鼠腫瘤增長［5］。此外，表沒食子兒茶素沒食子酸酯可以聯合紫杉醇、多柔比星等化療藥物，通過細胞周期阻滯、誘導凋亡等作用，發揮協同抗肝癌效果［6?7］。本研究擬在進一步明確表沒食子兒茶素沒食子酸酯抗肝癌作用的基礎上，重點關注其對免疫功能與VEGF、MMP2、MMP9 表達的影響，進一步闡明抗肝癌機制。

1 材料

1.1 瘤株與動物 小鼠肝癌H22細胞，購自美國ATCC 公司。SPF 級昆明種小鼠，體質量20～22 g，購自北京維通利華實驗動物公司，動物生產許可證號 SCXK（京）2014?0004。

1.2 藥物與試劑 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（批號170718，純度＞98.0%），購自四川維克奇生物科技有限公司；5?氟尿嘧啶（批號20180109），購自上海阿拉丁生化科技有限公司；白細胞介素?2（IL?2）及腫瘤壞死因子?α（TNF?α）檢測試劑盒（批號分別為180624、181008），購自南京建成生物工程研究所；血管內皮生長因子（VEGF）、基質金屬蛋白酶2（MMP2）及MMP9 抗體（批號分別為G0815、SC?13595、SC?16840），購自美國Santa公司；甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）抗 體（批 號20181204），購自杭州華安生物科技有限公司。

1.3 儀器 BSC?1100IIA2?X 生物安全柜（濟南鑫貝西生物技術有限公司）；I160 型CO2培養箱（美國Forma 公司）；CX31 生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；HC?2518RHC 高速冷凍離心機（安徽中科中佳儀器公司）；Mini?PROTEAN蛋白電泳儀（美國Bio?Rad 公司）；HBS?1096A 酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）。

2 方法

2.1 H22肝癌荷瘤小鼠模型建立及分組、給藥 小鼠按體質量隨機分為正常組、模型組、5?氟尿嘧啶組及表沒食子兒茶素沒食子酸酯高劑量、低劑量組，每組10 只。采用10%胎牛血清（含100 U／mL 雙抗），在飽和濕度、5%CO2、37 ℃條件下培養H22肝癌細胞至對數生長期，于小鼠腹腔中接種。小鼠腹部膨大后，處死小鼠，無菌操作抽取腹水，并調整至1×106／mL，模型組、5?氟尿嘧啶組、表沒食子兒茶素沒食子酸酯高劑量及低劑量組小鼠右腋皮下接種0.2 mL，正常組小鼠相同位置注射等體積生理鹽水。接種次日給藥，5?氟尿嘧啶組腹腔注射20 mg／kg 5?氟尿嘧啶，表沒食子兒茶素沒食子酸酯高劑量及低劑量組分別灌胃80、40 mg／kg的表沒食子兒茶素沒食子酸酯，持續7 d；正常組及模型組小鼠灌胃等體積的生理鹽水。

2.2 抑瘤率及臟器指數計算 末次給藥24 h 后稱定小鼠體質量，隨后摘眼球取血，分裝。一部分用于血液常規指標測定，一部分離心后分離血清，用于IL?2 及TNF?α 水平測定。頸椎脫臼法處死小鼠，完整剝離瘤塊、脾臟及胸腺，精密稱重，分別計算抑瘤率、脾臟及胸腺指數。抑瘤率＝［（模型組平均瘤質量－藥物處理組平均瘤質量）／模型組平均瘤質量］ ×100%，脾臟指數＝脾臟質量／體質量，胸腺指數＝胸腺質量／體質量。

2.3 血液常規指標測定 取“2.2”項下分裝的小鼠血液，采用小動物全自動血細胞分析儀測定各組小鼠血液中血紅蛋白水平及紅細胞數、白細胞數。

2.4 血清IL?2 及TNF?α 水平測定 取“2.2”項下分裝的血清，按照試劑盒說明書中的操作步驟，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定各組小鼠血清IL?2 及TNF?α 水平。

2.5 瘤組織VEGF、MMP2 及MMP9 表達測定 取各組小鼠瘤組織，勻漿，提取瘤組織總蛋白并定量。采用SDS?PAGE 電泳進行目的蛋白的分離，經轉膜、封閉后，加入VEGF、MMP2、MMP9（1 ∶1 000）抗體，4 ℃放置12 h。洗膜后，HRP 標記的二抗繼續孵育4 h，洗膜后進行曝光顯影。蛋白相對表達量為目的蛋白灰度值與內參GAPDH蛋白灰度值之比。

2.6 數據統計 通過SPSS 20.0 軟件進行處理，計量數據采用（）表示，單因素方差分析用于多組間比較，組間兩兩比較，方差不齊時采用Dunntt’s T3，方差齊時采用LSD 檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對荷瘤小鼠體質量、瘤質量及抑瘤率的影響 實驗前，各組小鼠體質量無差異（P＞0.05）。實驗后，與正常組比較，模型組小鼠體質量差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，5?氟尿嘧啶組小鼠體質量降低（P＜0.01），而表沒食子兒茶素沒食子酸酯高、低劑量組小鼠體質量差異無統計學意義（P＞0.05），說明5?氟尿嘧啶嚴重影響荷瘤小鼠的生長，對荷瘤小鼠機體存在明顯的損傷。與模型組比較，5?氟尿嘧啶組及表沒食子兒茶素沒食子酸酯高、低劑量組小鼠瘤重降低（P＜0.01），抑瘤率分別為52.2%、36.3%、29.2%，說明5?氟尿嘧啶及表沒食子兒茶素沒食子酸酯均可以明顯抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長。見表1。

表1 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對荷瘤小鼠體質量、瘤重及抑瘤率的影響（， n＝10）

表1 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對荷瘤小鼠體質量、瘤重及抑瘤率的影響（， n＝10）

注：與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對荷瘤小鼠臟器指數的影響 與正常組比較，模型組小鼠脾臟指數、胸腺指數均降低（P＜0.01）；與模型組比較，5?氟尿嘧啶組小鼠脾臟指數、胸腺指數均進一步降低（P＜0.01），而表沒食子兒茶素沒食子酸酯高、低劑量組小鼠脾臟指數、胸腺指數增加（P＜0.05，P＜0.01）。上述結果說明，表沒食子兒茶素沒食子酸酯可以增加小鼠免疫器官的質量，提升小鼠的免疫能力。見表2。

表2 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對荷瘤小鼠臟器指數的影響（， n＝10）

表2 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對荷瘤小鼠臟器指數的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對荷瘤小鼠血液常規指標的影響 各組小鼠血液血紅蛋白水平、紅細胞數變化無差異（P＞0.05）。與正常組比較，模型組小鼠血液白細胞數增加（P＜0.05）；與模型組比較，5?氟尿嘧啶組小鼠白細胞數降低（P＜0.01），而表沒食子兒茶素沒食子酸酯高、低劑量組小鼠白細胞數增加（P＜0.05，P＜0.01）。上述結果說明，表沒食子兒茶素沒食子酸酯可以增加荷瘤小鼠的白細胞數，提升小鼠的免疫能力。見表3。

表3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對荷瘤小鼠血液常規指標的影響（， n＝10）

表3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對荷瘤小鼠血液常規指標的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.4 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對荷瘤小鼠血清IL?2 及TNF?α 水平的影響 ELISA 檢測結果發現，與正常組比較，模型組小鼠血清IL?2、TNF?α 水平均降低（P＜0.01）；與模型組比較，5?氟尿嘧啶組小鼠血清IL?2、TNF?α 水平進一步降低（P＜0.01），而表沒食子兒茶素沒食子酸酯高、低劑量組小鼠血清IL?2、TNF?α 水平增加（P＜0.05，P＜0.01）。上述結果說明，表沒食子兒茶素沒食子酸酯可以通過提高免疫因子的水平，提升小鼠的免疫能力。見表4。

表4 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對荷瘤小鼠血清IL?2 及TNF?α 水平的影響（， n＝10）

表4 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對荷瘤小鼠血清IL?2 及TNF?α 水平的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對荷瘤小鼠瘤組織VEGF、MMP2 及MMP9 蛋白表達的影響 與模型組比較，5?氟尿嘧啶組及表沒食子兒茶素沒食子酸酯高、低劑量組小鼠瘤組織VEGF、MMP2 及MMP9 蛋白表達均降低（P＜0.01），其中5?氟尿嘧啶組下降幅度更為明顯。見表5、圖1。

表5 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對荷瘤小鼠瘤組織VEGF、MMP2 及MMP9 表達的影響（， n＝10）

表5 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對荷瘤小鼠瘤組織VEGF、MMP2 及MMP9 表達的影響（， n＝10）

注：與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖1 各組小鼠瘤組織VEGF、MMP2、MMP9表達

4 討論

機體的免疫能力與腫瘤的發生、發展密切相關。脾臟及胸腺是最主要的免疫器官，研究發現，荷瘤小鼠脾臟及胸腺常出現萎縮，而免疫促進劑可使其質量得到部分恢復［8］。本研究結果發現，表沒食子兒茶素沒食子酸酯可以增加小鼠免疫器官的質量，也可以升高白細胞數，具有提升小鼠免疫能力的作用。為進一步確認表沒食子兒茶素沒食子酸酯的抑瘤作用及免疫保護作用，本研究對各組小鼠血清IL?2 及TNF?α 水平進行了檢測。IL?2 是機體內重要的細胞免疫因子，在機體免疫系統中起到中心調節的作用，可以刺激免疫細胞活化，促進T 細胞的增殖和分化，提高機體免疫機能［9］。研究發現，貞芪酪蛋白肽復合物可以提高Lewis 肺癌荷瘤模型小鼠血清IL?2 水平，發揮抗Lewis 肺癌作用［10］。TNF?α 是目前已知的具有抗腫瘤作用最強的細胞免疫因子，其可以促進T 細胞產生炎癥因子，增強宿主免疫功能，誘導細胞凋亡；也可以直接殺傷腫瘤血管內皮細胞，發揮抗腫瘤作用［11］。研究發現［12］，白花丹醌具有體內抗肝癌H22移植性腫瘤模型小鼠腫瘤活性，其機制可能與增加TNF?α 的水平有關。因此，IL?2 和TNF?α 的水平可直接反映機體的免疫功能和抗腫瘤活性。本研究結果發現，表沒食子兒茶素沒食子酸酯可以通過提高免疫因子IL?2 和TNF?α 的水平，提升小鼠的免疫能力；而免疫能力的提高是表沒食子兒茶素沒食子酸酯發揮抗肝癌作用的潛在機制。

VEGF 能誘導蛋白水解酶、間質膠原酶等促使新生血管形成，從而為腫瘤生長提供基礎［13?14］。研究［15］發現，化痰消瘤方通過降低VEGF 的表達，抑制Lewis 肺癌瘤體生長。在生理條件下，基質金屬蛋白酶（MMPs）的降解、分泌及活性受到嚴格的調節和控制，而在腫瘤的發生、發展進程中，MMP2 及MMP9 等表達異常增加，進而引起腫瘤的生長［16］。大量研究證實，多種惡性腫瘤的生長與MMP2、MMP9 的異常高表達有關［17］。研究發現，姜黃素通過抑制外周血和腫瘤組織中MMP2、MMP9 的表達，發揮抗宮頸癌作用［18］。本研究結果發現，表沒食子兒茶素沒食子酸酯高、低劑量組小鼠瘤組織VEGF、MMP2 及MMP9表達均降低，進一步提示其具有抑制H22肝癌荷瘤小鼠腫瘤生長的潛在作用。

肝癌起病隱匿、進展迅速，是影響人類健康的重大疾病之一，借助化學藥物進行的化療是中、晚期肝癌的主要治療手段。傳統化療藥物由于不良反應大，對機體損害嚴重，整體效果難以令人滿意［19］。本研究結果最終表明，表沒食子兒茶素沒食子酸酯可以明顯抑制H22肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長，該作用與提高免疫力及抑制VEGF、MMP2、MMP9 表達有關。此發現，為把表沒食子兒茶素沒食子酸酯開發成為具有抗肝癌作用的臨床藥物提供了理論依據。