基于高內涵細胞影像分析系統的多種中藥成分肝毒性篩選與評價

余 璇馬 喆王 萌

（天津中醫藥大學中醫藥研究院 組分中藥國家重點實驗室，天津301617）

肝臟是人體藥物代謝的重要器官，也是藥源性損傷的主要靶器官之一［1］。中藥在發揮藥效的同時，一些有效成分或配伍中的其他成分會對肝臟產生一定的損害甚至造成藥源性肝損傷——指藥物及其活性代謝物通過脂質過氧化、細胞因子平衡失調而導致線粒體功能障礙，膜通透性改變，對細胞凋亡或壞死進行觸發，從而引起肝細胞損傷［2?3］。

中藥因其自身成分、作用機制復雜等因素，其藥源性肝損傷評價成本較高、試驗周期較長且結果爭議較大［4?5］。近年來，應用于肝毒性研究評價的新方法和新技術不斷發展，如肝細胞和亞細胞模型體外實驗法，精密肝切片法，斑馬魚模型，以及基于基因組學、代謝組學和蛋白質組學的實驗方法，但部分方法因儀器價格昂貴、技術要求較高等原因難以大范圍的使用［6?7］。

高內涵影像分析（HCA）是一種在細胞水平上的多系統、多途徑、多靶標的動態篩選技術，能夠在保持細胞結構和功能完整性的前提下，利用不同的熒光染料同時檢測化合物對細胞形態學、生化指標和細胞功能的影響，具有高通量、多指標、自動化、可定量等優點［8?9］。目前，HCA技術已用于肝毒性［10?11］、腎毒性［12?13］、心臟毒性［14］和神經毒性［15?16］的化合物篩選和研究。其中用于肝毒性檢測的報道較多，常見的篩選細胞株主要有HepG2，HepaRG，人原代肝細胞等［10?11］。其中HepG2 易于培養，分化程度較高，所含的生物轉化酶與人正常肝細胞具有同源性，是最為常用的藥物評價篩選工具細胞［17］。課題組前期建立了HepG2 的HCA 肝毒性評價方法，測定丹紅注射液、復方苦參注射液等四種臨床常用中藥注射液的肝毒性，并通過動物毒性試驗對HCA 結果進行驗證，得出該測定方法快速、簡便、準確［18］。另外，正常人肝細胞L02 具有典型的肝細胞形態學特征，更適用于谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和乳酸脫氫酶（LDH）滲漏率等多種肝損傷相關酶類的檢測［19］。近年來，利用該細胞對中藥成分進行HCA肝毒性篩選評價也可見報道［20］。有研究表明，同一成分在HepG2 和L02 上的敏感性不一致，如紫莖澤蘭對L02 的肝毒性作用大于HepG2［21］，而藤黃酸對HepG2 的毒性則大于L02［22］。另外，其抑制細胞增殖的作用機制也有一定區別。如補骨脂素對HepG2 和L02 均具有肝毒性但作用機制不一致，在L02 細胞上通過將細胞阻滯于S 期以抑制增殖，降低生存率，而在HepG2 上并無周期阻滯或誘導細胞凋亡的作用［23］。

本實驗在之前工作的基礎上，利用三種熒光探針建立并優化了基于L02 細胞的HCA 肝毒性評價方法。此外，選取2015 版《中國藥典》 中記載有大毒的藥物13 種，有毒的藥物50 種，有小毒的藥物35 種（表1），對除動物藥材（蜈蚣、蘄蛇）和礦物藥材（膽礬、紅粉、砒石、雄黃、鉛丹、密陀僧、朱砂）外的89 種植物藥進行文獻分析，根據報道確定了其中56 種可能具有潛在毒性的活性成分（表2）。通過建立的HCA 肝毒性檢測方法分別在人源性肝癌細胞HepG2 和人正常肝細胞L02 上進行肝毒性快速評價實驗，使用Hoechst 33342 熒光分子探針對細胞核進行染色，利用HCA 技術同時考察藥物對細胞生存率和細胞核面積的影響，并將兩種細胞株上的結果對比分析，以期對具有潛在肝毒性的藥物進行更準確的早期篩選。

表1 《中國藥典》 記錄的肝毒性藥物

表2 潛在肝毒性中藥成分

1 材料

1.1 細胞株 人肝癌細胞HepG2、人正常肝細胞L02，均購自中國科學院典型培養物保藏委員會上海細胞庫。

1.2 試劑 DMEM 培養基（批號1996842）、胰酶（批號1676922）購自美國Gibco 公司；胎牛血清（批號1658396）購自以色列Biological Industry 公司；青鏈霉素（批號1697550）購自美國HyClone 公司；Hoechst 33342（批號1801208）、Mito Tracker Deep Red FM（批 號1941460）、Rhodamine123（批號R?22420）熒光分子探針購自美國Invitrogen公司；DMSO 購自美國Sigma?Aldrich 公司。

1.3 儀器 IL?161HI CO2恒溫培養箱（施都凱儀器設備有限公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；Operetta高內涵篩選系統（美國PerkinElmer 公司）。

1.4 藥物 陽性藥碳酰氰?4?三氟甲氧基苯腙（FCCP）（批 號024M4003V）、對乙酰 氨基酚（APAP）（批 號061M0042V）購自美國Sigma?Aldrich 公司。56 種藥品及其代碼見表2，三七皂苷R1 購自天津一方科技有限公司，異常山堿、青藤堿、野百合堿購自上海源葉生物科技有限公司，其余藥品均購自天津中新藥業股份有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養 人肝癌細胞HepG2 和人正常肝細胞L02均培養于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM 培養基中，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，取對數生長期的細胞用于實驗。

2.2 藥物配制 FCCP 用DMEM 完全培養基分別稀釋至0.032、0.16、0.8、4、20、100 μmol／L，APAP 分別稀釋至0.032、0.16、0.8、4、20、100 mmol／L。各中藥活性成分經DMSO 溶解后，分別用DMEM 完全培養基稀釋至濃度1.0×10－6mol／L。

2.3 L02 細胞HCA 多指標肝毒性篩選方法的建立 收集對數生長期細胞，L02 調整細胞濃度至4×105／mL，每孔加入100 μL 細胞懸液，于37 ℃，5% CO2培養24 h。吸棄培養基，加入以DMEM 完全培養基稀釋的各濃度陽性藥（100 μL／孔），每組3 個復孔，于37 ℃、5% CO2下培養24 h。之后向每孔加入分別含Hoechst 33342 1 μg／mL、Mito Tracker Deep Red FM 0.25 μg／mL、Rhodamine123 1 μg／mL的DMED 完全培養基100 μL，于37 ℃、5% CO2下避光培養30 min，用DMEM 漂洗2 次。采用HCA，選擇Hoechst 33342、Mito Tracker Deep Red FM、Rhodamine123 三個通道對細胞進行影像學分析，計算細胞數量、細胞核面積、線粒體質量和線粒體膜電位4 項指標，考察陽性藥對細胞核數量、形態以及線粒體功能的影響。

2.4 多種中藥活性成分對HepG2 細胞和L02 細胞的肝毒性 在已建立的HCA 肝毒性檢測方法上進行簡化。收集對數生長期細胞，HepG2 和L02 的細胞培養方式同“2.3”項下。1×10－6mol／L 是在藥物篩選中較常用的起效濃度［24?25］，而阿霉素，順鉑等陽性藥在該濃度下也已表現出較明顯的毒性作用［12，26］，故各中藥活性成分以該濃度加入至各孔中，培養24 h，以Hoechst 33342 熒光探針進行染色，并對細胞進行影像學分析，計算細胞數量和細胞核面積，考察各中藥成分對細胞核數量和形態的影響。

2.5 統計學分析 采用Harmony 3.0、Columbus 軟件（美國Perkin Elmer公司）對HCA 圖像進行分析。通過GraphPad Prism 8.0、SPSS 21.0 對數據進行統計分析，多組間比較采用方差分析，P＜0.05 為差異無統計學意義。

3 結果

3.1 基于L02 細胞的HCA 肝毒性檢測方法 基于L02 細胞的HCA 肝毒性檢測結果見圖1～2。FCCP 對細胞生存率的半數抑制劑量（IC50）為3.560 μmol／L。在0.032～100 μmol／L濃度范圍內，可見細胞核面積隨濃度升高有明顯皺縮，線粒體質量明顯升高，線粒體膜電位發生改變，這與FCCP 能夠抑制線粒體呼吸鏈有關［27］。APAP 的IC50為5.389 mmol／L，與文獻報道基本一致［28?30］。L02 細胞線粒體質量和線粒體膜電位均有顯著下降。且細胞核面積在0.032～4 mmol／L 濃度范圍內有腫大趨勢，這是APAP 誘導細胞壞死和繼發性壞死而引起細胞器腫脹的形態學特征［31］。FCCP 與APAP 在L02 細胞上的多種指標表明，該方法準確可靠，可以用于潛在肝毒性藥物的快速篩選。

圖1 陽性藥對L02 細胞形態影響的HCA 代表圖像

圖2 FCCP 和APAP 對L02 細胞數目、線粒體質量、線粒體膜電位和細胞核面積的量效關系圖（n＝3）

3.2 中藥成分肝細胞毒性快速篩選研究 本實驗分別利用HepG2 和L02 的HCA 肝毒性檢測方法，以最直觀的細胞數目和細胞核面積為評價指標，分析56 種成分對兩種細胞的生存率和細胞核面積的影響，HCA 形態學代表圖見圖3，采用origin 2019b 對實驗結果繪制熱圖，見圖4。在HepG2細胞上，各中藥活性成分濃度1 μmol／L 時，A3、B3、A4、C3、D7、E4、E5、E6、E7、F1、F5、F6、G5、G6、H6 等15 種成分能夠引起細胞數目的下降，與空白組相比有統計學差異（P＜0.05，P＜0.01），表明它們對HepG2 有一定的增殖抑制作用；A3、A4、C3、E4、G5 等5 個成分的細胞核面積與空白組相比均有不同程度的減小，差異具有統計學意義，表明它們能夠引起HepG2 細胞核的皺縮。

圖3 兩種中藥活性成分對HepG2 細胞形態影響的HCA 代表圖像

圖4 各中藥活性成分（1 μmol／L）對HepG2 細胞生存率（A）、L02 細胞生存率（B）、HepG2 細胞核面積（C）、L02 細胞核面積（D）的影響（n＝3）

在L02 細胞上，A3、B3、C3、E7、E6、F1、F6、G5、G6、G7、H3、H6 等12 種成分會引起細胞數目的下降，與空白組相比差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），表明它們對L02 細胞有一定的毒性作用。另外，A3、B3、C3、E4、E5、E6、E7、F5、F6、G5、G6、G7、H6、H7 等14種成分能夠引起L02 細胞核不同程度的皺縮。

綜合分析各中藥活性成分在HepG2 和L02 上的HCA 肝毒性篩選結果發現，在1 μmol／L 濃度下能導致兩細胞株的細胞生存率均降低的藥物有雷公藤紅素（A3）、雷公藤甲素（B3）、雷公藤內酯酮（C3）、地高辛（E6）、杠柳次苷（E7）、鬼臼毒素（F1）、洋地黃毒苷（F6）、藤黃酸（G5）、西地蘭（G6）和去乙酰毛花苷（H6）。在對細胞生存率分析的基礎上，觀察各成分細胞核形態的變化，發現L02 的細胞核經Hoechst 染色后核面積明顯減小，皺縮程度劇烈，且均顯著高于HepG2，表明在同一藥物的影響下，L02 細胞可以更明顯的體現出細胞核形態的變化，對肝毒性評價的結果具有更清晰的指示性。

此外，補骨脂素（G7）可同時導致L02 細胞生存率的降低和細胞核面積減小，吳茱萸堿（H3）和補骨脂酚（H7）則分別對L02 的細胞生存率和細胞核形態產生明顯影響，且以上三種成分同一濃度下在HepG2 細胞上的生存率和細胞核形態均無顯著變化。而吳茱萸次堿（A4）和杠柳毒苷（D7）能夠導致HepG2 細胞生存率的降低。

4 討論

本實驗首先建立了HCA 肝毒性檢測方法，FCCP 是一種氧化磷酸化的解偶聯劑，通過破壞膜電位，抑制ATP 的生成，影響線粒體功能引起細胞損傷，產生肝毒性［32］。APAP 是臨床常用的解熱鎮痛藥，在代謝過程中，過量的高活性中間產物N?乙酰亞胺醌會與細胞蛋白尤其是線粒體蛋白中的巰基結合，引起氧化應激功能障礙導致肝細胞壞死［33］。實驗分別選擇了這兩種不同肝毒性機理的藥物作為陽性藥，并通過HCA 分析其細胞數量、細胞核面積、線粒體質量和線粒體膜電位4 項指標的變化，表明兩種陽性藥對細胞核和線粒體功能均產生了一定的影響，與已報道的文獻相符，檢測方法快速可行。

利用已建立的HCA 肝毒性檢測方法，對56 種中藥活性成分進行肝毒性檢測，有報道［25］表示細胞數目是藥物肝毒性檢測中最敏感的指標，在細胞凋亡早期即可檢測到，適合作為藥物毒性的篩選指標，而細胞核面積的變化是直觀反應細胞調亡和壞死的形態學指標。因此，本實驗選用細胞數目和細胞核面積，對具有潛在肝毒性的中藥成分進行初步快速篩選。

從實驗結果可以看出，對HepG2 和L02 細胞均有明顯毒性的成分主要有雷公藤中所含的雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷公藤內酯酮，強心苷類成分洋地黃毒苷、西地蘭、地高辛、去乙酰毛花苷和杠柳次苷，以及藤黃酸、鬼臼毒素等。有關雷公藤毒副作用的報道較為常見，主要有藥物性肝炎、肝功能異常、腎衰竭等，其中肝毒性的發生率最高，雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷公藤內酯均是已被明確報道的主要毒性成分［34］。藤黃酸具有較強的抗腫瘤作用，有研究表明藤黃酸對人肝癌細胞株HepG2（IC50為5.29 μmol／L）的毒性較大，而對人正常肝細胞株L02 作用相對較弱（IC50為27.96 μmol／L）［22，35］，與本文的研究結果一致。另外，強心苷類的治療窗窄、毒性作用強［36］，鬼臼毒素類［37］、吳茱萸堿［38］、吳茱萸次堿［39］、補骨脂素和補骨脂酚［40］等成分具有細胞毒性或抗腫瘤作用也均有報道。由于本實驗使用了HepG2 和L02 兩種肝細胞株且藥物作用濃度較低（1×10－6mol／L），故馬錢子堿、士的寧等有嚴重神經毒性的藥物［41］以及中烏頭堿、次烏頭堿等對心肌細胞更為敏感［42?43］的有毒藥物并未被篩選出來，也說明該方法具有一定的準確度和靈敏性。雖然HCA 檢測方法能夠從細胞水平上對藥物進行篩選，并多層次、多靶點的深入探討中藥的作用機制，但其是否能夠代表藥物在體內的代謝過程以及其毒性實驗結果與體內毒性相關性的綜合分析仍有待探討。

本實驗篩選出的十種能同時導致HepG2 和L02 細胞生存率明顯降低的藥物中，其L02 上細胞核皺縮的程度均明顯高于HepG2，說明L02 可以更明顯的體現出細胞核形態的變化，對肝毒性評價的結果具有更清晰的指示性。因此，我們認為兩種細胞株在肝毒性藥物的篩選上有一定差異，其綜合分析結果更具有代表性。本實驗成功建立了HCA 肝毒性檢測方法，并對56 種中藥活性成分的肝毒性進行快速評價，初步構建了中藥潛在肝毒性組分庫。該方法操作簡單，快速，穩定，特別適用于中藥復雜化學體系的初步毒性篩選評價。