基于網絡藥理學探究龍血竭對原發性高血壓食蟹猴血壓和生化指標的影響

方雪灣鐘建雄岳桂華林發全熊萬娜黎 芳梁健欽

（1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧530001； 2.梧州市人民醫院，廣西 梧州543000； 3.廣西衛生職業技術學院，廣西 南寧530023； 4.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧530021； 5.廣西中醫藥大學中藥制劑共性技術研發重點實驗室，廣西 南寧530001； 6.廣西優勢中成藥與民族藥開發工程技術研究中心，廣西 南寧530001）

原發性高血壓（essential hypertension，EH）是一種常見的心血管系統疾病，臨床表現以體循環動脈壓升高為主，可誘發及促進冠狀動脈粥樣硬化、腦血管意外、心肌梗死等病的發生，具有患病率高、并發癥多的特點，中醫認為EH 屬“中風”“頭痛”“眩暈”等范疇。課題組通過流行病學調查方法分析632 例高血壓病患者的中醫癥狀與證候要素的相關性，發現高血壓病的中醫證候要素分布中瘀證占47.9%［1］，在另外一項調查中［2］發現痰濕質、濕熱質、血瘀質3 種體質體現出EH 患者的民族差異性，可見血瘀是高血壓患者一個重要證型。因此，中西醫結合治療高血壓可從改善靶器官微循環著手，活血化瘀在治療中具有重要意義［3］，臨床發現活血化瘀方法治療EH 獲得良好療效［4?5］。龍血竭是從植物劍葉龍血樹Dracaena cochinchinensis（Lour.）S.C.Chen 的含脂木材中提取得到的樹脂［6］，是傳統名貴中藥和壯藥，具有抗血栓、抗炎、抗菌、活血、止血、活血化瘀等作用［7?11］。課題組［12］證實龍血竭還有降血壓作用。本文考察龍血竭對EH 食蟹猴血壓及血小板、凝血酶的影響，評價龍血竭的降壓作用和對凝血的影響，最后借助網絡藥理學方法，構建成分靶點、EH 疾病靶點的互作網絡，挖掘EH 的發病機制，預測龍血竭的藥理作用和機理，預測龍血竭治療EH 的化學成分、作用靶點和作用通路，以期為龍血竭的藥效物質研究提供基礎，同時為后續作用機制的驗證實驗提供的理論依據，對龍血竭藥理作用的發現以及新藥研發具有重要意義。

1 材料

1.1 藥物 龍血竭（廣西中醫藥大學制藥廠，批號20150301）；卡托普利片（湖南湘雅制藥有限公司，批號1511111）。

1.2 儀器 日立7600?020 全自動生化分析儀（日本日立公司）；ST16R 型臺式低速溫離心機（美國Thermo 公司）；MDF?UT386S 型－80 ℃超低溫冰箱（日本SANYO 公司）；Dash 2500 監護儀［通用電氣醫療系統（中國）有限公司］。

1.3 動物 EH 食蟹猴（符合WHO?ISH 《高血壓治療指南》 公布的診斷標準：收縮壓≥140 mmHg 和／或舒張壓≥90 mmHg）、正常血壓食蟹猴，均由廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司提供，動物使用許可證號SYXK（桂）2014?0004。

1.4 數據庫及軟件 TCMSP 數據庫（http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php ）、PubChem Compound 數據庫（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）、TTD 數據庫（https：／ ／db.idrblab.org／ttd／）、String 數據庫（version 11.0，https：／ ／string?db.org／）、Drugbank 數據庫（version 5.1.1，https：／ ／www.drugbank.ca／）、UniProt 數據庫（https：／ ／www.uniprot.org／）、DRAR?CPI 數據庫（http：／ ／cpi.bio?x.cn／）、PubMed 數據庫（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／pubmed／）、CNKI 數據庫（http：／ ／www.cnki.net）、GeneCards 數據庫（https：／ ／www.genecards.org／）、MalaCards數據庫（https：／ ／www.malacards.org／）、RCSB PDB（https：／ ／www.rcsb.org／）、Venny2.1.0（https：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html）、Cytoscape（version 3.7.2）、SPSS（ver?sion 17.0）。

2 方法

2.1 EH 食蟹猴入選 入選EH 模型的食蟹猴須同時滿足以下條件（1）非同日連續6 d 測得平均血壓≥140／90 mmHg；（2）剔除繼發性高血壓的、EH 并發其他疾病的、現仍服用藥物或服藥后未過洗凈期的、不配合血壓檢測的。最終，從324 只成年食蟹猴中篩選得到16 只EH 食蟹猴，雄性14 只、雌性6 只，年齡（18.8±3.7）歲，體質量（7.9±1.9）kg。

2.2 動物分組與給藥 EH 食蟹猴隨機分為龍血竭高劑量組（0.72 g／kg）、龍血竭低劑量組（0.18 g／kg）、卡托普利陽性對照組（7.52 mg／kg）和模型組，每組4 只，正常血壓食蟹猴4 只（雄、雌各半）為空白對照組，各組均自由進食、飲水，環境溫度20～25 ℃，相對濕度40%～60%。除空白對照組、模型組灌胃給予安慰劑（由食用色素、水調配至顏色與CDB 相近，即得）外，其他各組灌胃給予相應藥物，每天1 次、每周連續給藥6 d，4 周為1 個療程，共4 個療程。

2.3 指標測定 在食蟹猴清醒狀態下測定收縮壓、舒張壓，連續6 次取平均值，隔1 d 測定1 次，比較組間及治療前后血壓的變化情況。在食蟹猴空腹狀態下，分別于給藥治療前、每周最后1 次給藥后2 h 抽取血靜脈血各8 mL，采用全自動生化分析儀檢測血小板和凝血酶原時間。

2.5 龍血竭化學成分及其作用靶點分析 龍血竭包含多種化合物，主要包括黃酮類、查耳酮類、多聚查耳酮類、黃烷類、高異黃烷類、色原酮類、簡單酚類、甾體皂苷類、三萜類、脂肪醇及其酯類等［13?14］，通過TCMSP 和PubMed等數據庫搜索龍血竭成分，結合CNKI 及NCBI 文獻報道的龍血竭 主要化 學成分，通 過 TCMSP、ChemSpider、PubChem 等數據庫進行化合物結構確證，最后以TCMSP 數據庫中化合物的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug?likeness，DL）≥0.18［15］以 及Lipinski 原則［16］為標準，篩選得出目標化合物，保存為mol2 格式文件，導入DRAR?CPI 數據庫預測成分靶點。以Z’ ?score＜－1.0 為標準［17］篩選出各成分對應的靶蛋白。使用Uniprot 及RCSB PDB 數據，把PDB ID 及對應的靶蛋白轉換成對應的基因名稱（gene name），即靶點。若PDB ID對應多個基因，則核對相對應的靶蛋白進行選擇基因，確保靶蛋白和基因名一對一，并去除查找不出結果的PDB ID及對應蛋白，匯總去重，最終得到成分靶點。

2.6 EH 疾病靶點分析 以“essential hypertension”為關鍵詞在TTD 中進行檢索，使用UniProt 數據庫對TTD 中獲取的疾病靶點進行認證，去除搜索結果為非“homo sapiens（Human）”的靶點及蛋白名和靶基因名（target Name）不一致靶點，最終獲得EH 病癥靶點。

2.7 KEGG、GO 富集分析和關聯的疾病分析 將靶點導入String 數據庫，進行KEGG、GO 富集分析。提取前10 條信號通路，分別采用MalaCards 數據庫進行相關疾病分析，對每條通路搜索結果的前200 個疾病進行匯總統計，得到相關性最大的前10 種疾病。

2.8 網絡可視化 Cytoscape 構建可視化網絡。節點的大小由degree 決定，degree 越大，節點越大；節點顏色由聚類系數決定，顏色相近的節點為同一類。

3 結果

3.1 組間收縮壓、舒張壓的比較 在收縮壓比較方面：（1）給藥前，各組與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），說明入選的EH 食蟹猴的收縮壓高于普通食蟹猴的；（2）給藥后，與模型組比較，卡托普利陽性對照組、龍血竭高劑量組收縮壓降低（P＜0.05），龍血竭低劑量組組未顯示降低收縮壓的作用（P＞0.05）（3）給藥前后，龍血竭低劑量組組間均無統計學意義（P＞0.05）。在舒張壓比較方面：（1）給藥前，各組與空白對照組比較有統計學意義（P＜0.05），說明入選的EH 食蟹猴的舒張壓高于普通食蟹猴的舒張壓；（2）給藥后，與模型組相比，卡托普利陽性對照組、龍血竭高劑量組可降低舒張壓（P＜0.05），但龍血竭低劑量組未顯示降低舒張壓作用（P＞0.05）。因此，龍血竭具有降低EH 食蟹猴收縮壓、舒張壓的作用。見表1。

表1 龍血竭對EH 食蟹猴血壓的影響（， n＝4，1 mmHg＝0.133 kPa）

表1 龍血竭對EH 食蟹猴血壓的影響（， n＝4，1 mmHg＝0.133 kPa）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。

3.2 組間血小板計數的比較 龍血竭低劑量組對血小板計數沒有影響（P＞0.05），龍血竭高劑量組在給藥后第3、4周血小板計數水平降低（P＜0.05），說明龍血竭對血小板數有減少作用，但對高血壓狀態下血小板數減少作用的起效時間較長。見表2。

表2 龍血竭對EH 食蟹猴血小板數量的影響（， n＝4）

表2 龍血竭對EH 食蟹猴血小板數量的影響（， n＝4）

注：與給藥前比較，*P＜0.05。

3.3 組間活化部分凝血酶原時間的比較 龍血竭低劑量組在給藥后第2、3 周，龍血竭高劑量組在第3、4 周，縮短活化部分凝血活酶時間（P＜0.05）。以上說明，CDB 可縮短活化部分凝血活酶時間，這與龍血竭止血作用有關［18］，其作用機制可能與縮短活化部分凝血活酶時間有關。見表3。

表3 CDB 對EH 食蟹猴活化部分凝血活酶時間的影響（， n＝4）

表3 CDB 對EH 食蟹猴活化部分凝血活酶時間的影響（， n＝4）

注：與給藥前比較，*P＜0.05。

3.4 EH 疾病靶點及發病機制分析 通過TTD 數據庫搜索得到76 個疾病靶點，經篩選得出EH 疾病靶點46 個，包括ACE、ADRA1B、ADRB2、ADRB3、AVPR1A、EDNRA、PTGIR、REN等。如圖1 所示，疾病靶點網絡由46 個節點及207 條邊組成，平均節點度為9，平均局部聚類系數為0.599。GO 分析發現EH 與血液循環、血管直徑的調節、血壓調節、化學信號介導的系統性動脈血壓調節、第二信使介導的信號轉導等412 個生物過程相關；與G 蛋白偶聯受體活性、信號受體活性、跨膜信號受體活性、G 蛋白偶聯胺受體活性、腎上腺素能受體活性等51 個分子功能有關。KEGG 分析結果顯示疾病靶點主要富集在神經活性配體?受體相互作用、鈣信號通路、cGMP?PKG 信號通路、腎素分泌、血管平滑肌收縮等29 條通路或途徑上，即EH 發病與上述通路異常有關。

圖1 疾病靶點?通路網絡圖

3.5 CDB 的主要成分、作用靶點和疾病 經篩選得出18個化合物，分別是龍血素A、龍血素B、龍血素C、龍血素D、2′?甲氧基異甘草素、2，4，4′?三羥基二氫查耳酮、刺甘草查耳酮、劍葉龍血素A、劍葉龍血素B、劍葉龍血素C、7，4′?二羥基黃酮、7，4′?二羥基黃烷、7，4′?二羥基?3′?甲氧基黃烷、甘草素、異甘草素、Farnisin、Broussin、柑橘素，成分作用靶點116 個。GO 分析發現CDB 主要成分與代謝過程、對化學物質的反應、對有機環狀化合物的響應、對脂質的反應、有機氮化合物代謝過程等1 052 個生物過程相關；與催化活性、類固醇激素受體、核受體活性、離子結合、轉移酶活性等129 個分子功能有關。KEGG 分析結果顯示成分靶點主要富集在癌癥的途徑、代謝途徑、內分泌抵抗、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、MAPK 信號通路、補體與凝血級聯等152 條通路或途徑上，即龍血竭主要成分通過調節上述通路治療系列疾病。對排名前10 的通路進行分析，發現龍血竭可能作用的疾病分別是血管疾病、高血糖、心臟病、肺病、缺血、白血病、癌癥、胰島素樣生長因子Ⅰ缺乏癥、肝病及細胞因子缺乏癥等。見圖2。

圖2 龍血竭的“成分?靶點?通路?疾病”網絡圖

3.6 龍血竭對EH 的作用機制分析 將化學成分靶點及疾病靶點匯總去重得匯總靶點158 個，二者共同靶點為4 個，利用Venny 2.1.0 繪制疾病靶點及成分靶點韋恩圖，如圖3所示。將158 個靶點導入String 數據庫建立蛋白互作關系，并將結果導入Cytoscape 構建互作網絡圖（圖4），由158 個節點及750 條邊組成，平均節點度為9.49，平均局部聚類系數為0.445。GO 分析結果顯示龍血竭可調節血液循環、對化學物質的反應、對刺激的反應、對含氧化合物的反應、血管直徑的調節等1 262 個生物過程，以及分子功能與催化活性、分子換能器活性、信號受體活性、類固醇激素受體、核受體活性等158 個分子功能。KEGG 分析結果顯示龍血竭可調控神經活性配體?受體相互作用、鈣信號通路、癌癥的途徑、cGMP?PKG 信號通路、cAMP 信號通路等158 條通路，可能通過調節上述生物過程及通路防治EH。

圖3 疾病靶點?成分靶點韋恩圖

圖4 龍血竭影響EH 的“成分?靶點?通路”網絡圖

4 討論

心血管疾病的治療成為當今中、西醫學界的研究熱點。治療高血壓病的西藥甚多，作用靶點明確，降壓速度較快，但副作用相對較大。中藥治療高血壓方面，降壓幅度雖不及西藥，但其作用持久。許多中藥及復方制劑被證實可以減輕患者左室肥厚，具有在降壓的同時影響血液流變學和脂質代謝，從而降低冠心病患病率，減少靶器官的損害，中藥對于高血壓病的長期防治是重要的［19］。

血瘀是高血壓患者重要證型。研究表明，高血壓患者中血瘀者約占76.7%，且各期均出現不同程度的血瘀證候，并以III 期＞II 期＞I 期為趨勢，血瘀證貫穿于高血壓病的始終［20］。如前所述，課題組發現高血壓病的中醫證候要素分布中瘀證占47.9%［1］，且發現痰濕質、濕熱質、血瘀質3種體質體現出EH 患者的民族差異性［2］。因此，中西醫結合治療高血壓的方法之一是活血化瘀法。傳統的活血化瘀中藥或復方的確顯示一定降壓作用［21?23］，其機制大多有擴張血管、改善微循環［24］、降低血栓素、升高前列腺素水平［25］、降低血管緊張素［26］等。本實驗分別給予龍血竭、卡托普利，考察龍血竭對EH 食蟹猴血壓的影響，證實龍血竭對EH 食蟹猴有降血壓作用，作用大小與劑量有關。

EH 與血液微循環功能障礙密切相關，可能伴隨血管內皮損傷。血液微循環功能障礙會導致血管和微血管受損，導致血液中的血小板聚集增加，同時血管內皮損傷的加劇會導致凝血功能出現問題。本實驗證實了龍血竭對EH 食蟹猴血小板有抑制作用，并可縮短活化部分凝血活酶時間，具有活血化瘀作用。

EH 食蟹猴的動物實驗中觀察到龍血竭可以降血壓，但是考慮到龍血竭是一種中藥提取物，其降壓的成份有效和作用靶點尚未清楚。因此，在藥效的基礎上，本文進一步借用網絡藥理學的研究方法，通過數據網絡對生物系統進行分析，構建藥物?靶點?疾病網絡互作圖，具有系統性、整體性，能較好地對CDB 的作用機理進行初步預測。本文采用網絡藥理對CDB 中的已知成份及作用靶點進行分析，發現龍血竭可治療包括心血管在內的多種疾病，這與龍血竭的“活血化瘀”功效一致。通過GO 分析和KEGG 通路分析，又發現龍血竭可能通過對AVPR1A、GATM、F7 等靶點，參與調節血液循環、循環系統中的血管過程、對脂質的反應、調節血壓等，參與腎素分泌、鈣信號通路、神經活性配體?受體相互作用等信號通路的調控。

綜上所述，龍血竭對EH 食蟹猴具有降壓作用，抑制高血壓狀態下的血小板聚集，縮短高血壓狀態下活化部分凝血酶原時間。龍血竭降壓作用可能通過作用于AVPR1A、GATM、F7 等靶點，調控鈣信號通路及神經活性配體?受體相互作用等通路或途徑有關。龍血竭的藥理作用體現了CDB 治療EH 的“多成分?多靶點?多通路”的作用特點，從理論層面整體解釋了龍血竭影響血壓的機理，但其有效成份、作用靶點和通路仍需進一步驗證。