基于網絡藥理學探究黃連?干姜藥對治療手足口病的作用

曹志明吳巧鳳

（浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州310053）

手足口病（Hand?foot and mouth disease，HFMD）自2008 年納入丙類傳染病以來，一直成為丙類傳染病中發病率最高的疾病［1］。HFMD 多發生于5 歲以下的學齡兒童，其臨床癥狀主要為發熱，手、足、口腔等部位出現皮疹或皰疹，重癥者可導致死亡。HFMD 的常見病原體為柯薩奇病毒A16 型（Coxsaekievirus type A16，CA16）和腸道病毒71 型（Enterovirus 71，EV71），其中EV71 導致HFMD 的輕癥、重癥和死亡病例數分別占HFMD 輕癥、重癥和死亡病例數的40.2%、61.9%、92.9%［2］。

迄今，臨床尚無治HFMD 的特效藥，僅能采取藥物（如蘆平曲韋和利巴韋林等）進行對癥治療。中醫認為HFMD 屬于“瘟疫，溫熱夾濕”等范疇，常以清熱解毒中藥進行治療［3］，如黃連、金銀花和連翹等。研究發現黃連中的鹽酸小檗堿可通過激活AKT、抑制JNK 和PI3K Ⅲ蛋白磷酸化抑制EV71 誘導的自噬［4］。但黃連性寒，易傷脾胃，常與溫熱藥物（干姜，紫蘇和厚樸等）配伍使用。黃連?干姜藥對最早出自于《傷寒論》 中的干姜黃芩黃連人參湯和半夏瀉心湯［5］，兩藥一寒一熱，相互制約，共奏調理腸胃，消痞除滿之效。但黃連?干姜藥對抗HFMD 的研究未見報道。

網絡藥理學是基于藥物?成分?靶點?疾病為基礎的交互式網絡，涉及化學信息學、生物信息學、網絡生物學和藥理學等諸多學科［6］，可系統性地揭示藥物與疾病間的復雜關系，進而闡釋中藥配伍的潛在機制［7］。分子對接是通過計算蛋白（受體）三維結構與成分（配體）之間幾何和能量匹配程度，從而達到篩選活性成分的目的［8］。本文運用細胞實驗、網絡藥理學和分子對接預測黃連?干姜藥對治療HFMD 的潛在靶點、機制及其活性成分，為深入研究黃連?干姜藥對治療HFMD 的靶點、機制和活性成分及新藥研發提供參考。

1 材料

1.1 藥物與試劑 利巴韋林（批號20181202），購自湖北百科藥業股份有限公司；MEM 培養液（批號1760237）、胎牛血清（批號1347575）、谷氨酰胺（批號1677185）、25% EDTA?胰酶（批號1737903）、PBS（批號1740269）均購自美國Gibco 公司；黃連（批號20170601）和干姜（批號20190801），均購自浙江中醫藥大學中藥飲片廠，經浙江中醫藥大學中藥資源與鑒定教研室俞冰副教授鑒定，分別為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch 的干燥根莖和姜科植物姜Zingiber officinaleRosc 的干燥根莖。

1.2 病毒和細胞株 腸道病毒71 型（EV71）、橫紋肌瘤細胞株（RD），均由浙江省疾病預防控制中心病毒所提供。1.3 儀器 705 型－80 ℃超低溫冰箱、3111 型CO2 恒溫培養箱（美國Thermo 公司）；ABI?7300 Real?time 檢測儀（美國ABI 公司）。

2 方法

2.1 細胞實驗

2.1.1 藥物提取 黃連?干姜藥對（黃連12.5 g、干姜12.5 g）及其單味藥（黃連、干姜各25 g），加10 倍純水回流提取2 次（1 h／次），提取溫度100 ℃，合并2 次濾液，過濾、濃縮至50 mL（質量濃度0.5 g／mL）；利巴韋林100 mg，用純水稀釋至10 mL（質量濃度10 mg／mL）。

2.1.2 藥物對RD 細胞毒性的測定 黃連?干姜藥對、黃連、干姜和利巴韋林藥液過0.22 μm 微孔濾膜，用MEM培養液倍比稀釋，并加到已長滿RD 細胞的24 孔培養板（重復3 個復孔，每孔1 mL），同時設置正常細胞對照組，于5% CO2、37 ℃培養箱中培養24 h，觀察CPE，確定各藥液的最大無毒濃度。

2.1.3 藥物對EV71 感染RD 細胞模型病毒載量的影響100 μL 100 TCID50的EV71 加到已長滿RD 細胞的24 孔板，于5% CO2、37 ℃培養箱中培養1 h 后，PBS 洗2 次，分別加入各藥液最大無毒濃度（重復3 個復孔，每孔1 mL），并同時設正常細胞對照組和病毒對照組，于5% CO2、37 ℃培養箱中培養，24 h 后終止培養，觀察CPE，于－80℃凍存，解凍后提核酸，并采用RT?PCR 測CT 值，并計算病毒載量。

2.1.4 統計學處理 采用Excel 2010 對數據進行處理，結果以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2.2 黃連?干姜藥對的成分篩選及相關靶點靶點查詢 將黃連、干姜分別輸入中藥系統藥理學數據庫TCMSP（http：／ ／tcmspw.com／tcmsp.php）中進行搜索，得到與HFMD 相關成分115 個，其中黃連32 個、干姜85 個，并獲取與成分對應的靶點。

2.3 HFMD 靶點獲取和藥對?化合物?靶點?疾病網絡圖構建 在OMIM 數據庫（http：／ ／www.omim.org／）和Gene?cards 數據庫（https：／ ／www.genecards.org／）中搜索“Hand?foot and mouth disease”相關靶點。用R 3.6.2 和Cy?toscape 3.7.2 分別構建藥對靶點和HFMD 靶點vene 圖和藥對?成分?靶點?HFMD 網絡圖。

2.4 蛋白質?蛋白質相互作用（PPI）網絡圖構建 交集靶點導入String 數據庫（https：／ ／string?db.org／cgi／input.pl?sessionId＝H6GfU4n40mOM＆input_ page_ show_ search ＝on）中分析，結果用Cytoscape 3.7.2 做PPI 網絡圖。

2.5 GO 富集和KEGG 通路分析 交集靶點導入DAVID 數據庫（https：／ ／david.ncifcrf.gov／summary.jsp）進行GO富集和KEGG 通路分析。

2.6 分子對接進行活性成分篩選 EV712A 和3C 蛋白酶均是由EV71 編碼的半胱氨酸蛋白水解酶，2A 蛋白酶可加速多聚蛋白水解為前體蛋白，3C 蛋白酶可將前體蛋白切割為成熟結構蛋白和非結構蛋白［9］。因此2A 和3C 蛋白酶在EV71 感染宿主至關重要，成為篩選抗EV71 藥物的重要靶點［10］。從RSCB PDB 數據庫（http：／ ／www.rcsb.org／）下載EV712A 蛋白酶（PDB ID：4FVB［11］）和3C 蛋白酶（PDB ID：3SJO［12］）pdb 結構，通過pymol 2.3 對蛋白進行前處理（添加氫、除水和設置活性中心），并保存為pdb格式；從TCMSP 數據庫下載黃連?干姜藥對中成分的mol2格式，然后導入Chemdraw 3D 18.1 進行能量最低處理并保存為pdb 格式，通過AutodockTool 1.5.6 將蛋白和成分轉化為pdbqt 格式。用AutoDock vina 進行對接，pymol 2.3 對結果進行可視化。

3 結果

3.1 細胞實驗 黃連?干姜藥對、黃連、干姜和利巴韋林在RD 細胞的最大無毒濃度分別為1.56、0.39、25、4 mg／mL；黃連?干姜藥對、黃連和干姜均能降低EV71 感染RD 細胞模型的病毒載量，與病毒對照組相比具有統計學意義（P＜0.05）。黃連?干姜藥對對EV71 的抑制效果僅次于利巴韋林，遠高于黃連和干姜，見表1。

表1 黃連?干姜藥對及其單味藥對EV71 感染RD 細胞模型病毒載量的影響（n＝3）

3.2 黃連?干姜藥對的成分篩選 通過TCMSP 數據庫檢索黃連?干姜藥對成分198 種，其中與HFMD 相關成分115種，涉及黃連32 種、干姜83 種。

3.3 藥對靶點和疾病靶點vene 圖和藥對?化合物?靶點?疾病網絡圖 在OMIM 數據庫中搜索HFMD 相關基因522 個，Genecards 數據庫中搜索HFMD 相關基因4 081 個。HFMD基因與和黃連?干姜藥對基因取交集，獲得87 個基因，繪制藥對靶點和疾病靶點vene 圖，見圖1。Cytoscape 3.7.2繪制藥對?化合物?靶點?疾病網絡圖，圖中共有634 條邊和205 個節點，其中化學成分115 個、靶點87 個、黃連和干姜共2 個、HFMD1 個，見圖2。

圖1 黃連?干姜藥對靶點和HFMD 靶點vene 圖

圖2 黃連?干姜藥對?化合物?靶點?HFMD 網絡圖

3.4 PPI 網絡圖 用Cytoscape 3.7.2 做PPI 網絡圖，圖中有85 個關聯靶蛋白和837 條邊（顏色越深表示與其他靶蛋白關聯越強）。與其他蛋白關聯最強的前4 位靶點依次為INS、TP53、IL6 和MYC，見圖3。

3.5 靶點通路分析 在DAVID 數據庫中，GO 富集分析篩選得到GO 條目334 條（P＜0.05），涉及生物過程（BP）240 條、細胞組成（CC）37 條、分子功能（MF）56 條，選取BP、CC 和MF 各自的前20 條做柱狀圖，見圖4；KEGG 通路富集分析篩選得到69 條信號通路（P＜0.05），涉及癌癥、PI3K?Akt、p53、Apoptosis 和Toll?like receptor 等多條信號通路，見圖5。

圖4 黃連?干姜藥對作用靶點的GO 富集分析BP、CC 和MF 各自前20 條通路柱狀圖

圖5 黃連?干姜藥對作用靶點的KEGG 通路分析前60 條通路柱狀圖

3.6 分子對接結果 運用AutoDock Vina 將黃連?干姜藥對所含成分與EV712A 和3C 蛋白酶分別進行對接，并按所得結合自由能（affinity）從低到高進行排序，與2A 蛋白酶和3C 蛋白酶結合自由能最低的前10 位單體，見表2～3。由圖6 可知，銀杏雙黃酮與2A 蛋白酶的氨基酸殘基HIS?21、THR?126 和ASN?129 形成常規氫鍵，與SER?87 形成碳氫鍵，與GLU?85、GLY?128 和PRQ?107 形成酰胺鍵，與LEU?131，VAL?84 和GLY?127 形成π?烷鍵；老鸛草素與2A 蛋白酶的氨基酸殘基HIS21、SER?87 和GLY?108 和GLY?127 形成常規氫鍵，與HIS?21 形成π?π 鍵。由圖7 可知，老鸛草素與3C 蛋白酶的氨基酸殘基GLY?164、THR?142、HIS?161、CYS?147、CLN?22 和HIS?40 形成常規氫鍵，與CYS?147 和SER?128 形成碳氫鍵，與CYS?147 形成π?硫鍵。異銀杏雙黃酮與3C 蛋白酶的GLY?164、GLY?145、HIS?24、GLN?42 和ARG?39 形成常規氫鍵，與LEU?127、HIS?40 和CYS?147 分別形成π?烷鍵、π?π 鍵和π?硫鍵（常規氫鍵綠色表示、碳氫鍵白色表示，酰胺鍵紅色表示、π 類鍵（π?烷鍵、π?π 重疊鍵、硫?π 鍵）淡紫色表示）。這些鍵使活性成分與蛋白酶緊密結合，從而使2A 和3C 蛋白酶失去活性。

圖6 銀杏雙黃酮和老鸛草素與2A 蛋白酶的結合模式

圖7 老鸛草素和異銀杏雙黃酮與3C 蛋白酶的結合模式

表2 黃連?干姜藥對所含成分與2A 蛋白酶的對接得分最低的前十位化合物

4 討論

近年來，HFMD 的發病率和致死率在我國呈不斷上升趨勢［13］。Yamayoshi、Liu 發現EV71 可通過多條途徑感染宿主細胞［14?15］，一兩種受體阻斷藥無法完全阻斷其感染。尋找具有多靶點的新藥已成為國內外研究的新趨勢。本文運用細胞實驗、網絡藥理學和分子對接研究黃連?干姜藥對治療HFMD 的靶點、機制和活性成分，為多靶點治療HFMD 新藥研發提供參考。

表3 黃連?干姜藥對所含成分與3C 蛋白酶對接得分最低的前十位化合物

細胞實驗顯示，黃連?干姜藥對及其單味藥均可抑制EV71 在RD 細胞中復制，黃連?干姜藥對的藥效遠高于其單味藥，體現出中藥寒熱配伍的合理性。

網絡藥理學得到與HFMD 基因相關的黃連?干姜藥對成分115 種，潛在靶點87 個，GO 富集、KEGG 通路分析分別得到333、69 條。核心靶點包括TP53 和IL6 等，P53（TP53 編碼的抑癌蛋白）可直接調控與干擾素通路相關的多個基因（IRF9［16］、IRF5［17］和ISG15［18］）表達，促進干擾素產生，進而發揮先天性抗病毒作用；IL?6 是內源性炎癥介質，既可對炎癥進行雙向調節，激活炎癥反應［19］，又可誘導B 和T 淋巴細胞分泌抗體發揮免疫作用，從而參與宿主的防御應激［20］。GO 功能分析涉及炎癥反應、MAPK激酶級聯反應、細胞凋亡和信號傳導等多個生物過程。KEGG 通路分析涉及PI3K?Akt、p53、NF?κB、Apoptosis、Toll?like receptor 等通路。EV71 可促使宿主細胞活性氧的積累，影響PI3K?Akt［21］、NF?κB［22］、Toll?like receptor［23］等多條信號通路，促使干擾素釋放和炎癥因子表達；EV71 也可激活PI3K?Akt［24］、P53［25］等通路影響細胞凋亡，從而發揮強大的抗EV71 作用；

2A 蛋白酶活性中心由HIS?21、ASP?39 和CYS?110 組成［26］；3C 蛋白酶活性中心由HIS?40、GLU?71 和CYS?147組成［27］。分子對接表明，老鸛草素與2A 蛋白酶的HIS?21形成氫鍵和π?π 鍵；與3C 蛋白酶的HIS?40 形成氫鍵和CYS?147 形成氫鍵和π?硫鍵，從而抑制2A 和3C 蛋白酶的活性。實驗研究也發現老鸛草素既可抑制EV71 在RD 細胞中復制，又可緩解感染EV71 小鼠的臨床癥狀和降低小鼠肌肉組織中的病毒載量，從而降低小鼠死亡率［28］；銀杏雙黃酮和異銀杏雙黃酮是一種天然的黃酮類蛋白抑制劑［29］，銀杏雙黃酮可與EV71 2A 蛋白酶的HIS?21 形成氫鍵和π?π鍵，從而抑制2A 蛋白酶的活性，研究發現銀杏雙黃酮具有較強的抗病毒作用，對皰疹病毒（HSV?1 和HSV?2）［30］和流感病毒（H1N1 和H3N2）［31］均具有抑制作用；異銀杏雙黃酮可與EV71 3C 蛋白酶的HIS?40 形成π?π 鍵和CYS?147 形成π?硫鍵，從而抑制3C 蛋白酶的活性，研究表明異銀杏雙黃酮對杜氏利什曼原蟲、錐體蟲和金黃色葡萄球菌等感染均具有抑制作用［32］。

本文運用細胞實驗、網絡藥理學和分子對接對黃連?干姜藥對治療HFMD 的靶點、機制和活性成分進行預測，結果表明黃連?干姜藥對可通過多成分、多靶點和多通路協同治療HFMD。由于網絡藥理學和分子對接的局限性，后期可通過細胞和動物實驗深入研究黃連?干姜藥對治療HFMD的靶點、機制和活性成分。