基于網絡藥理學探究三葉湯治療咳嗽的作用和配伍規律

賴艷妮詹少鋒劉小虹黃慧婷*

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州510405； 2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州510405）

“咳嗽”在現代醫學中是一種常見的呼吸道癥狀，屬于一種重要的防御機制，而在中醫學中則屬于肺系疾病中獨立的病名。《黃帝內經》 中提出“五臟六腑皆令人咳，非獨肺也”，認為“咳”本屬肺病，但不是肺獨有之病，有肺病及于他臟而為咳者，有他臟病及于肺而咳者［1］。《傷寒論》 繼承了“五臟六腑皆令人咳”的理論，將咳嗽歸納為六經病癥［2］。

三葉湯由“三葉”（枇杷葉、龍脷葉、人參葉）為君，苦杏仁、浙貝母、紫菀、款冬花、桔梗、牛蒡子、防風、木蝴蝶、甘草等相伍組成，是嶺南醫家治療多種原因引起的急、慢性咳嗽的經驗方，通過臨床辨證加減化裁，對治療鼻后滴流綜合征慢性咳嗽［3］、咳嗽變異型哮喘［4］、風燥犯肺型感染后咳嗽［5］、喉源性咳嗽［6］常可獲得良好的效果。然而，對于三葉湯治療咳嗽基礎研究的報道仍處于空缺的狀態，且中藥多成分、多靶點的特點限制了中藥的進一步開發和走向國際化。網絡藥理學從整體觀出發，構建藥物、分子、靶點、疾病之間的多重網絡關系，多層次、全面地闡明中藥方劑的藥理作用機制［7］，為中醫藥的發展提供了新的視角。本研究擬通過借助網絡藥理學的理念和方法，對三葉湯中君、臣、佐、使治療咳嗽的分子機制和配伍規律進行剖析，為進一步開發和臨床運用提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 TCMSP 數據庫［8］（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform／中藥系統藥理學數據庫與分析平臺，http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／tc?msp.php ）；DAVID 數據庫（Laboratory of Human Retrovirology and Immunoinformatics，https：／ ／david.ncifcrf.gov）；CTD 數據庫（The Comparative Toxicogenomics Database／比較毒物基因組學數據庫，http：／ ／ctdbase.org）；Polysearch 數據庫（http：／ ／polysearch.cs.ualberta.ca）；STRING 數據庫［9］（https：／ ／string?db.org／cgi／input.pl）；Venny2.1.0 工 具（http：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html）；Cytoscape3.7.1 軟件；gProfiler 工具［10］（https：／ ／biit.cs.ut.ee／gprofiler／gost）。

1.2 三葉湯潛在活性成分及靶點的獲取 將評估藥物活性的兩個重要參數——生物口服利用度≥20%（oral bioavail?ability，OB）及類藥性≥0.15（Drug?likeness，DL）作為初次篩選潛在活性成分的重要閾值［11］（每味中藥化學成分中主要的活性成分及特征成分也將納入為潛在活性成分），從TCMSP 數據庫中獲得三葉湯潛在活性成分及潛在預測蛋白靶點。利用DAVID 數據庫的基因名稱轉換工具，將蛋白靶點轉換為基因名。

1.3 三葉湯治療咳嗽候選活性成分及靶點的篩選 結合CTD 數據庫、Polysearch2 數據庫及String 數據庫，獲得目標疾病（咳嗽）的靶點。使用韋恩圖工具Venny2.1.0，將疾病靶點與三葉湯潛在預測靶點進行維恩圖的繪制，并篩得三葉湯治療咳嗽的候選靶點。

1.4 三葉湯治療咳嗽“藥物?活性成分?靶點”網絡及蛋白互作網絡的構建 通過整合三葉湯治療咳嗽的候選活性成分?靶點的文本數據，運用Cytoscape3.7.1 軟件分別構建三葉湯君藥、臣藥、佐藥、使藥組合治療咳嗽的“藥物?活性成分?靶點”網絡。通過軟件中的NetworkAnalyzer 工具進行網絡拓撲性質分析，同時運用cytoHubba 工具進行Hubba nodes 的分析，獲得以degree 為算法的在該網絡中排名前70 的核心節點并構建核心節點互作網絡。

1.5 基因本位（GO）及KEGG 富集分析 使用gProfiler工具對核心靶點進行GO 富集分析，包括生物學過程（Bio?logica lProcess，BP）、細胞組 分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）富集分析。結合Cytoscape 軟件中的ClueGO 工具，將核心靶點進行KEGG 富集分析，并使用CluePedia 進行富集網絡的可視化。

2 結果

2.1 三葉湯治療咳嗽潛在活性成分及其靶點信息 通過檢索TCMSP 數據庫中三葉湯組成藥物（枇杷葉、人參葉、龍脷葉）的各自所含化學成分及對應預測靶點，共獲得446種化學成分及303 個預測靶點，通過OB 值和DL 值篩選后，剩余潛在活性成分17 種。另外，三味中藥中一些沒有達到OB 和DL 值閾值的主要活性成分也納入潛在活性成分中，如龍脷葉中的合金歡基丙酮［12］，枇杷葉中的蘆丁、異槲皮苷、熊果酸、齊墩果酸及科羅索酸［13?14］。從CTD 數據庫中獲取的與“咳嗽”相關的靶點共有19 171 個，三葉湯預測靶點中共有277 個靶點與“咳嗽”相關。Degree≥3 的潛在活性化合物詳細信息如表1 所示，degree≥3 的潛在關鍵靶點詳細信息如表2 所示。

表1 三葉湯君藥組合潛在活性成分基本信息

表2 三葉湯君藥組合潛在關鍵靶點

2.2 網絡分析

2.2.1 君藥?潛在活性成分?靶點網絡分析 分析網絡的拓撲性質可以有效、快速、全面地了解核心活性成分及靶點，有助于進一步掌握三葉湯君藥治療咳嗽的分子作用機制。如圖1 所示，該網絡共有個271 節點（黃色三角形為中藥、紫色圓形為潛在活性成分、紅色六邊形為靶點），形成的最短路徑共有73 170 條（節點間的連線代表相互作用），網絡異質性參數為3.352，集中性參數為0.458。Degree 值越大，則節點越大，表明該節點在網絡中越為重要。以de?gree 為橫坐標（X），對應節點數（nodes）為縱坐標（Y），形成的冪函數為Y＝39.638X－0.991，相關性系數為0.963，R2為0.690。

圖1 三葉湯君藥候選活性成分?靶點互相作用網絡

2.2.2 君藥核心節點網絡分析 在三葉湯君藥治療咳嗽Degree 排名前70 的核心“藥物?活性成分?靶點”網絡互作圖（圖2）中，枇杷葉（degree ＝17）和人參葉（degree ＝4）在方藥中占據較重要的位置，即對應的活性成分和／或靶點所占比例較多（三角形為中藥，圓形為活性成分，六邊形為靶點，顏色越深表明該節點在網絡中的degree 越大）。活性成分方面，排名較前的分別有MOL000098（degree ＝126）、MOL006821（degree ＝105）、MOL000422（degree ＝56）、MOL000358（degree ＝35）、MOL000354（degree ＝30）、MOL001002（degree ＝17）、MOL000511（degree ＝12）、MOL002372（degree ＝7）、MOL000878（degree ＝ 6）、MOL000415（degree ＝ 6）、MOL005344（degree ＝ 4）、MOL000359（degree ＝ 4）、MOL012588（degree ＝ 4）、MOL012579（degree ＝ 4）、MOL012578（degree＝4）。靶點前列腺素G ／ H 合成酶2（PTGS2）、孕酮受體（PGR）、凝血因子X（F10）、DNA 拓撲異構酶2?α（TOP2A）、核受體 輔激活因子2（NCOA2）、Caspase?3（CASP3）、細胞凋亡調節因子BAX（BAX）、轉錄因子p65（RELA）、熱休克蛋白HSP 90?α（HSP90AA1）、前列腺素G（PTGS1）、凋亡調節因子Bcl?2（BCL2）、黃嘌呤脫氫酶（XDH）、轉錄因子AP?1（JUN）、腫瘤壞死因子（TNF）、γ?氨基丁酸受體亞基α ?1（GABRA1）、磷脂酰肌醇?4，5?二磷酸3?激酶催化亞基γ（PIK3CG）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、雄激素受體（AR）的degree 依次為9、6、6、6、5、5、5、5、5、5、4、4、4、4、4、4、4、4。

圖2 三葉湯君藥核心節點網絡

2.3 君藥基因本位（GO）及KEGG 富集分析 運用gPro?filer 工具將三葉湯中君藥的40 個潛在關鍵靶點分別進行GO?CC（Cellular Component／細胞組 分）、GO?MF（Molecular Function／分子功 能）、GO?BP（Biological Process／生物過程）。

GO?CC 富集結果共有23 個條目具有顯著性，顯著性前20 的條目（圖3）有細胞外空間、細胞質、質膜、細胞外區域、細胞外基質、細胞表面、膜筏、核質、小窩、受體復合物、線粒體外膜、質膜的組成部分、細胞質的核周區域、質膜外側、細胞外外泌體、線粒體、核染色質、核、突觸后膜和血小板α 顆粒腔等細胞組分。

圖3 GO?CC 富集結果

GO?MF 富集結果中具有顯著性意義的條目共有27 個，顯著性前20 的條目（圖4）包括酶結合、蛋白質結合、相同的蛋白質結合、蛋白激酶結合、蛋白質同源二聚化活性、藥物結合、轉錄因子結合、蛋白質異二聚化活性、支架蛋白結合、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA 結合、糖蛋白結合、蛋白酪氨酸激酶活性、序列特異性DNA 結合、RNA 聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區序列特異性DNA 結合、蛋白激酶活性、轉錄激活因子活性，RNA 聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區序列特異性結合、蛋白磷酸酶2A 結合、類固醇激素受體活性、轉錄因子活性，序列特異性DNA 結合及絲氨酸型內肽酶活性等分子功能。

圖4 GO?MF 富集結果

GO?BP 富集結果共有145 個條目具有顯著性，排名前20 的條目（圖5）有對藥物的反應、對脂多糖的反應、衰老、來自RNA 聚合酶II 啟動子的轉錄的正調節、轉錄的正調節，DNA 模板化、對雌二醇的反應、細胞增殖的正調節、基因表達的正調節、凋亡過程的負調節、對缺氧的反應、炎癥反應、一氧化氮生物合成過程的正調節、細胞對缺氧的反應、對乙醇的反應、血管生成的正調節、細胞對機械刺激的反應、對有毒物質的反應、ERK1 和ERK2 級聯的正調節、平滑肌細胞增殖的正調節。

圖5 GO?BP 富集結果

40 個潛在關鍵靶點KEGG 富集分析結果（圖6）表明，三葉湯君藥治療咳嗽主要涉及低氧誘導因子?1（HIF?1）、腫瘤壞死因子（TNF）、磷脂酰肌醇?3?激酶／蛋白激酶B（PI3K／Akt）等信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、I 型跨膜蛋白質（Toll 樣受體）、血管內皮生長因子（VEGF）和松弛素（Relaxin）信號通路。與肺部疾病相關的疾病信號通路包括小細胞肺癌、結核、甲型流感、百日咳等。最后利用Cytoscape 軟件中的CluePedia 工具將40 個潛在關鍵靶點富集的疾病通路與相關基因進行網絡的構建和可視化（圖7），不同顏色代表不同的簇（cluster），顏色相同代表功能組分相似，這有利于進一步探討潛在目標基因與疾病通路之間的相互作用。

圖6 KEGG 富集結果

圖7 KEGG 富集信號通路?基因網絡

2.4 臣?佐?使藥組合的網絡分析 中醫藥治療疾病注重君臣佐使相伍相配，以達到最好的藥效發揮作用。為了更好地理解三葉湯中“臣?佐?使”藥的作用特點及配伍規律，分別對方中的臣藥組合“苦杏仁?款冬花?浙貝母?紫菀”、佐藥組合“木蝴蝶?桔梗?防風?牛蒡子”及使藥“甘草”進行網絡藥理的剖析，同時構建藥物?活性成分?靶點網絡圖（圖8～10）。紅色正方形為中藥，綠色三角形為活性分子，黃綠色圓形為靶點。基于OB、DL 值，同時通過文獻查閱保留每味中藥的主要活性成分和特征成分，初步共篩得211 個候選活性成分（未給出），針對疾病“咳嗽”進一步篩得75 個潛在活性成分（表3）和16 個預測靶點（表4）。

表4 臣?佐?使藥預測靶點

圖8 臣藥組合網絡分析圖

表3 臣?佐?使藥潛在活性成分

臣藥組合共篩選出18 個化合物和12 個與“咳嗽”相關的靶點（圖8）。靶點分別為F2、NOS3、EGF、VEGFA、SERPINE1、ADRA2A、ADRA2B、OPRD1、DRD2、OPRM1、OPRK1、ADRA2C。KEGG 富集分析表明其主要與信號通路神經活性配體?受體相互作用及HIF?1 信號通路相關聯；GO功能分析提示其主要涉及調節體液水平、磷脂酶C 激活G蛋白偶聯受體信號傳導途徑、金屬離子傳輸的調節、激酶活性的正調節和調節鉀離子的轉運、白細胞介素?4 和白細胞介素?13 信號傳導等分子功能；

佐藥組合共篩選出30 個化合物和12 個與“咳嗽”相關的靶點（圖 9）。F2、OPRM1、NOS3、ALB、EDN1、SERPINE1、GCG、PYY、VEGFA、ADRA2A、EGF、ADRA2B。KEGG 富集提示其與HIF?1 信號通路相關；GO 功能分析表明第二信使介導的信號傳導、調節體液水平、離子傳輸的調節、信號受體活性的調節、傷口愈合的積極調節、對神經系統發育的積極調節、組織穩態血小板激活，信號傳導和聚集及GPCR 配體結合與其關系密切；

圖9 佐藥組合網絡分析圖

使藥共篩選出38 個化合物和8 個與“咳嗽”相關的靶點（圖 10 ）。OPRM1、F2、OPRD1、NOS3、STAT3、VEGFA、EGF、SERPINE1。KEGG 富集提示HIF?1 信號通路與其顯著相關；GO 功能分析表明其與鈣離子轉運、受體介導的內吞作用的正調節、血液凝固的負調節、神經系統過程的調節、急性炎癥反應及白細胞介素?4 和白細胞介素?13信號傳導等分子功能密切相關。

圖10 使藥網絡分析圖

3 討論

三葉湯是嶺南醫家以疏風潤肺止咳為組方原則，以止嗽散加減所創。用以治療嶺南地區治療多種原因引起的急、慢性咳嗽。方中“三葉”枇杷葉、龍脷葉、人參葉清均為清輕之品，借“治上焦如羽，非輕不舉”之法，清化相配，降潤相合，為治療肺家咳嗽之良藥。三葉湯化裁后對鼻后滴流綜合征慢性咳嗽（風痰肺燥型）［3］、咳嗽變異型哮喘［4］、風燥犯肺型感染后咳嗽［5］、喉源性咳嗽［6］等療效顯著。

在臨床療效確切的前提下，本研究擬借助網絡藥理學的研究方法，從細胞、分子層面剖析三葉湯中君?臣?佐?使藥的配伍規律和藥理作用機制。在篩選出來的15 個君藥潛在活性成分中一些活性成分已有治療肺系疾病的相關研究報道：如研究表明人參皂苷Rh2（G?Rh2）對小鼠哮喘具有保護作用，其機制可能與抑制磷酸化AKT、p38MAPK 以及NF?κB 信號通路有關［15］。槲皮素能通過抑制炎性介質TNF?α、IL?8 的釋放而改善ALI 大鼠的氣體交換功能，從而減輕內毒素誘導的急性肺損傷［16］。異鼠李素作為槲皮素的中間代謝產物，對脂多糖（LPS）誘導的急性肺損傷（ALI）模型有保護作用［17］，可在體內和體外通過調控MAPKs 和NF?κB 信號通路顯著抑制TNF?α，IL?1β 和IL?6 的分泌，減輕ALI 模型的中性粒細胞浸潤及水腫。

對40 個君藥關鍵靶點進行KEGG 富集，結果提示三葉湯君藥治療咳嗽的藥理作用機制可能與松弛素、低氧誘導因子?1、VEGF 等信號通路有關。研究表明，松弛素（relaxin，RLX）對肺有保護作用，可通過激活cAMP／PKA 途徑增強Epac 協同PKA 抑制ERK1／2 磷酸化，減輕ASMCs 增生來減輕氣道炎癥反應［18］。低氧誘導因子?1（HIF?1）在LPS 導致的大鼠急性肺損傷中HIF?1 可通過VEGR、SDF1 及CXCR4等靶基因的表達促進肺損傷的修復［19?20］。VEGF 是哮喘氣道重塑和炎癥的介質，可通過刺激血管內皮細胞的增殖、增加血管通透性來促進支氣管內新血管的生成［21］。

對臣藥?佐藥?使藥組合進行網絡藥理剖析，發現均可通過HIF?1 信號通路，協同君藥調節巨噬細胞等炎癥細胞介導的炎癥反應并及時促進肺損傷的修復。同時臣藥組合還與白細胞介素?4 和白細胞介素13 的水平密切相關，而研究表明白細胞介素4 和13 分別在咳嗽變異型哮喘、支氣管哮喘的急性發作期起重要作用［22?23］。

綜上所述，三葉湯君藥可能是通過調控松弛素、腫瘤壞死因子、血管內皮生長因子、低氧誘導因子?1、I 型跨膜蛋白質等信號通路，抑制氣道炎癥反應，減輕氣道重塑，促進支氣管內心血管的生成，減輕肺部損傷，從而達到治療小細胞肺癌、結核、甲型流感、百日咳等肺部疾病的作用。臣?佐?使藥則可通過調節HIF?1 信號通路、白細胞介素?4 和白細胞介素13 的水平協助君藥抑制炎癥反應，減輕肺部損傷，達到協同配伍的作用。本研究借助網絡藥理學的研究方法，篩選了三葉湯治療“咳嗽”的關鍵靶點和潛在活性分子，初步探討了君藥?臣藥?佐藥?使藥的藥理作用機制和協同配伍作用特點，為三葉湯的進一步開發和臨床運用提供了科學依據。