基于網絡藥理學探究健心膠囊治療心律失常的作用

浦 強唐海軍徐蕾蕾王婧偉王麗曉沈安明

（如皋市中醫院，江蘇 如皋226500）

心律失常是心臟科高發病和常見病，可單獨發病，亦可與其他心血管疾病伴發，是臨床上常見而極具危險性的心血管疾病［1］。心律失常常因冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓心肌病、心肌炎、風濕性心臟病、甲狀腺功能亢進等器質性心臟病引起，主要發病機制為心臟活動的起源和傳導障礙導致心臟搏動的頻率或節律異常，臨床表現有心悸、心慌、胸悶、疲乏氣短，常伴有頭暈、出汗、呼吸困難等癥狀，嚴重者可出現暈厥，甚至猝死［2?3］。臨床治療有藥物治療、射頻消融、植入性心律轉復除顫器、心臟再同步化及心臟復律除顫器等，主要仍以抗心律失常藥物治療為主，但抗心律失常藥物治療效果不顯著，副作用大，有致心律失常作用，容易造成二次傷害，且存在改善癥狀不理想、耐藥及減藥后反復發作等問題。因此，越來越多的人尋求中醫中藥的治療，對緩解癥狀、提高生活質量、降低毒副作用，減少疾病反復發作具有重要作用。

中醫學認為心律失常按臨床表現屬于“心悸、怔忡”等范疇。《素問·至真要大論》及《靈樞·本神》就有“心澹澹大動”“心怵惕”惕惕然而驚，心欲動”的記載。這些記載與心律失常的表現基本吻合。中醫學認為該病發病虛實夾雜，虛者氣血陰陽虧虛，心失濡養；實者痰飲、瘀血、濕熱、火邪上擾，心神不寧，正虛邪戀，互累發病。病機關鍵為陰陽失調，氣血失和，心神失養。治療以益氣和血，寧心安神，調理陰陽為主［4?5］。

健心膠囊（黃芪、苦參）由江蘇省如皋市中醫院基于中醫經典理論、采用傳統工藝研發的院內制劑（蘇藥制字Z04001612），方中黃芪味甘，微溫，補虛，補氣要藥；苦參味苦，寒，主心腹結氣，補中，能安五臟，定志，黃芪、苦參相配，祛邪扶正，具有益氣寧心作用，用于治療良性心律失常（室性早搏、房性早搏等）、病毒性心肌炎、心臟神經官能癥等，臨床療效滿意［6?7］。前期實驗研究也表明，健心膠囊能改善氯仿誘發的小鼠室顫，氯化鋇和腎上腺素致大鼠的心律失常作用，其作用機理可能是多通道阻滯和β 受體阻斷的多重作用，亦可能與影響植物神經及其遞質，或者改變膜對Na＋、Ca2＋、K＋等離子的轉運，從而影響膜的電生理特性有關［8］。但由于中藥化學成分復雜多樣，作用機制具有多靶點、多環節等特點。健心膠囊治療心律失常具體作用機制尚未完全明確。

網絡藥理學研究方法采用分析藥物、基因、蛋白、疾病等數據庫與實驗室所得數據，融合多學科的技術和內容，從系統、整體的水平構建多層次網絡，去分析藥物作用機制［9］。利用網絡藥理學來預測多成分、多途徑、多靶點、協同作用的中藥復方及配伍作用機制具有顯著的優勢。本研究利用網絡藥理學研究方法研究健心膠囊治療心律失常藥效物質及作用靶點，以期為進一步研究健心膠囊提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 健心膠囊主要候選化合物收集和篩選 根據健心膠囊中2 味中藥黃芪（Astragali Radix）、苦參（Sophorae Flaves?centis Radix）在2015 年版《中國藥典》 中的規范名稱，使用中藥系統藥理學 數據庫 和分析平臺［10］（TCMSP）（http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）收集健心膠囊的所有生物活性化合物。以口服生物利用度（oral bioavail?ability，OB）≥30%、類藥性（Drug?likeness，DL）≥0.18為限制條件進行篩選［11］，得到健心膠囊的主要候選活性化合物。并結合中國知網、Pubmed 數據庫等文獻對于未能入選的化學成分，但報道其有生物活性和藥理作用的也納入候選活性化學成分，建立藥物?化學成分數據集。

1.2 健心膠囊主要候選化合物潛在作用靶點收集 采用TCMSP 數據庫檢索健心膠囊主要候選化學成分相關的潛在作用靶點，進而使 用UniProKB（https：／ ／www.uniprot.org／），剔除非人源靶點，將查詢得到的所有蛋白名稱校正為官方名稱（Official symbol）。化合物通過檢索Puchem 數據庫［12］（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）查詢結構，生物活性等詳細信息。采用網絡圖像化軟件Cytoscape 3.7.2 軟件構建“中藥?化合物?作用靶點”網絡圖，以探究健心膠囊的藥理學作用機制。

1.3 心律失常相關疾病靶點收集 采用PharmGkb 數據庫［13］、NCBI Gene 數據庫［14］、OMIM 數據庫［15］、TTD 數據庫［16］、Drugbank 數據庫［17］、DisGeNET 數據庫［18］。在數據庫中通過檢索關鍵詞“cardiac arrhythmia；arrhythmia”收集與心律失常相關靶點基因，整理后建立心律失常相關靶點數據集。

1.4 “中藥?化合物?作用靶點?疾病”網絡的構建和分析 將健心膠囊主要候選化合物作用靶點與心律失常靶點數據集進行韋恩（Venn）分析，得到共同的基因集，初步挖掘健心膠囊治療心律失常的作用靶點。進而構建“中藥?化合物?作用靶點?疾病”網絡圖，節點（node）代表健心膠囊單味中藥、化合物與作用疾病靶點，邊（edge）用來連接中藥與化學成分、化學成分與作用疾病靶點，顯示中藥?化學活性成分?心律失常疾病靶蛋白的靶向關系，以探究健心膠囊治療心律失常的藥理學作用機制。

1.5 靶點類 型歸屬 DisGeNET［18］（http：／ ／www.disgenet.org／，Version 6.0，2019 年1 月更新）數據庫是一個包含與人類疾病相關的基因和變體集合的公開數據庫，將“1.4”項下潛在靶點輸入DisGeNET，得到靶點的類型（Protein Class）。

1.6 蛋白質?蛋白質互作網絡構建 將“1.4”項下得到的交集靶蛋白基因在線上傳String 數據庫（https：／ ／string?db.org／），限定物種人，得到蛋白互作信息，構建蛋白質?蛋白質相互作用關系（Protein?Protein Interaction，PPI）網絡圖，尋找靶點和靶點間作用關系［19］，利用Cytoscape 3.7.2軟件中的cytoNCA 插件功能，進行網絡拓撲學分析選出核心靶點，其在網絡中信息傳遞效率高，能更多地影響其他節點，在網絡中作用顯著。分析內容選取度（Degree cen?trality，DC）值，介度中心性（Betweenness centrality，BC）值，接近中心性（Closeness centrality，CC）值等［20］。

1.7 富集分析 利用DAVID 工具（https：／ ／david.ncifcrf.gov／，David 6.8），將“1.4”項下共同靶點基因導入功能注釋工具，進行Gene Ontology（GO）、KEGG 功能注釋富集分析。Gene Ontology 富集分析包括生物過程（Biological Process）、細胞組 成（Cellular Component）、分子功 能（Moleular Function），與KEGG Pathway 富集分析共同尋找活性成分作用靶點顯著富集的功能注釋與通路，以預測健心膠囊治療心律失常的可能機制。以P＜0.05 為篩選條件。

2 結果

2.1 健心膠囊候選化學成分信息及篩選結果 本研究通過TCMSP 數據庫對健心膠囊中黃芪、苦參所含生物成分進行檢索，以OB≥30%和DL≥0.18 為限制條件對健心膠囊活性生物成分進行初步篩選，并結合文獻報道，對沒有入選但明確有心血管獲益的活性的成分，如黃芪甲苷（astraga?loside Ⅳ）、黃芪皂苷（astragaloside Ⅰ?Ⅲ）、氧化苦參堿（oxymatrine）等［21?22］，也納入后續的研究中，去掉重復化合物，得到活性生物成分結果為黃芪26 種、苦參46 種，見表1。

表1 健心膠囊中68 個候選化合物

續表1

2.2 健心膠囊主要化學成分潛在作用靶點收集結果 檢索70 個候選化合物相關的潛在靶點，其中有MOL006571 等27 個化合物在數據庫中未找到相關靶點，故予剔除。剩余化合物，共得到232 個作用靶點，其中黃芪214 個，苦參207 個。采用Cytoscape3.7.2 軟件構建“中藥?化學成分?作用靶點”網絡圖（圖1），網絡圖中包括275 個節點（2 個中藥節點，41 個化合物節點，232 個作用靶點節點）和813 條邊。其中綠色節點代表中藥，黃色和粉紅色節點代表化合物，藍色節點代表化合物對應的潛在靶點，每條邊則代表化合物分子與靶點之間的作用關系。其中槲皮素（quercetin）、芒柄花黃素（formononetin）為黃芪、苦參共有化合物。一個節點的度值（degree）表示網絡中和節點相連路線的數目。分析網路圖degree 值前5 位化合物依次為槲皮素quercetin（149），山柰酚kaempferol（63），木犀草素luteolin（57），7?O?甲基異 丙醇胺7?O?methylisomu?cronulatol（46），芒柄花黃素formononetin（40）。這些數據表明，這些degree 值高的化合物有可能在健心膠囊的藥理功能中發揮著較為重要的作用。

圖1 中藥?化學成分?作用靶點相互作用網絡圖

2.3 心律失常相關疾病靶點的收集 采用OMIM 數據庫、PharmGkb 數據庫、Drugbank 數據庫、TTD 數據庫、DisGeNET 數據庫及NCBI Gene 數據庫，通過檢索關鍵詞“cardiac arrhythmia；arrhythmia”收集心律失常相關靶點基因，分別收集到56、4、55、19、131、173 個，剔除重復，共收集到274 個心律失常相關疾病靶點。

2.4 健心膠囊潛在作用心律失常靶點信息、靶點類型歸屬健心膠囊潛在作用靶點和心律失常疾病靶點Venn 分析，得到22 個共同的靶點基因（圖2）。并且將交集靶點集導入DAVID 數據庫，限定物種人，將所有靶基因名稱校正為其官方名稱（official gene symbol），得到22 個共同靶點（表2）。其中，黃芪對應21 個靶點，苦參對應19 個靶點，多數靶點2 種藥物都同時具有。將這22 個靶點輸入Dis?GeNET 數據庫，得到靶點類型的信息，包括酶（水解酶、氧化還原酶、轉移酶、連接酶、激酶、細胞連接蛋白酶等）、轉運體、轉錄因子、受體、核酸受體等（表2），表明健心膠囊通過不同靶點類型發揮藥效，且這些作用靶點共同作用、互相調節可能增強了健心膠囊治療作用。

表2 健心膠囊潛在抗心律失常靶點

圖2 健心膠囊潛在作用靶點?心律失常疾病靶點Venn 圖

2.5 “中藥?化學成分?作用靶點?疾病”網絡的構建和分析結果 利用Cytoscape 3.7.2 軟件構建“中藥?化學成分?作用靶點?疾病”網絡，分析網絡：網絡中有61 個節點（其中中藥2 個，化學成分節點35 個，靶基因節點23 個，疾病節點1 個）和184 條邊（圖3），根據網絡藥理學篩選方法，平均Degree 值為4，篩選所得核心化合物，這些化合物可能是健心膠囊發揮治療抗心律失常作用的關鍵（表3）。

圖3 中藥?化學成分?作用靶點?疾病網絡圖

表3 健心膠囊治療心律失常核心化合物拓撲分析

2.6 蛋白質?蛋白質互作網絡構建及分析 將“2.4”項下得到的22 個基因檢索String 數據庫，得到蛋白與蛋白之間的互相作用信息，蛋白互作關系，并進一步導入Cytoscape軟件，如圖4 所示。該網絡圖中PDE3A 與其他靶點之間無相互作用，故網絡圖中未顯示；包含21 個節點、46 條邊，代表了蛋白之間相互作用，網絡中degree 值越大，節點越大，而Combine score 值越大，邊越粗，各節點的平均自由度為4，篩選得到NOS3（12）、IL6（10）、SLC6A4（8）、GJA1（7）、PRKCA（6）、PTGS2（6）、ADRA1B（5）、MMP3（5），推測這些靶點可能是健心膠囊治療心律失常的重要靶點，表明健心膠囊治療心律失常可能通過多個靶點聯合共同發揮作用。

圖4 潛在核心靶蛋白互作網絡圖

2.7 GO 注釋及KEGG 通路富集分析

2.7.1 靶點生物學功能GO 注釋結果 使用DAVID 工具對獲得的健心膠囊潛在治療心律失常的22 個靶標基因進行GO 富集分析，結果提示生物過程中主要富集到血管收縮的積極調節、腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路、血小板活化、細胞?細胞信號傳導、積極調節平滑肌收縮、去甲腎上腺素?腎上腺素血管收縮參與全身動脈血壓的調節、細胞溶質鈣離子濃度的正調節、對藥物的反應、調節心室肌細胞膜復極化等，細胞組成中富集到細胞質膜、細胞質膜的整體成分，分子功能中富集到α1 腎上腺素能受體活性、支架蛋白結合、酶結合，可見健心膠囊涉及多個生物學過程發揮作用（表4）。

表4 健心膠囊治療心律失常候選靶點的GO 富集

2.7.2 靶點KEGG 通路富集分析結果 使用DAVID 工具對獲得的共同靶標基進行KEGG 富集分析，以P＜0.05 為基準篩選，共獲得17 個通路富集，包括環鳥苷酸?蛋白激酶G（cGMP?PKG）信號通 路、血管內 皮生長因子（VEGF）信號通路、心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導、唾液分泌、鈣離子信號通路、血管平滑肌收縮、神經活性配體?受體相互作用、間隙連接、HIF?1 信號通路、PI3K?Akt 信號通路、雌激素信號通路、阿米巴病、TNF 信號通路、5?羥色胺能突觸通路、癌癥通路、鞘脂信號通路、醛固酮調節的鈉重吸收等。并通過Omicshare（http：／ ／www.omicshare.com／tools／Home／Soft／search）對富集分析結果進行可視化處理。其中，Y 軸代表通路名稱；X 軸代表富集因子（RichFactor，即目標基因中屬于這個通路的基因的數量／背景基因集中這個pathway 所有基因的數量）；氣泡面積大小代表目標基因集中屬于這個通路的基因數量；氣泡顏色代表富集顯著性，即P?value 數值的大小（圖5）。

圖5 健心膠囊治療心律失常候選靶點KEGG 富集分析

3 討論

中醫治療以整體觀念、辨證論治為基本原則，中藥化學成分復雜，且復方作用機制和配伍機制較難分析，具有多成分、多靶點、多途徑的特點。而網絡藥理學具有整體性和動態性的特點，為我們提供了研究中藥的一種新策略。本研究基于網絡藥理學手段，通過對健心膠囊進行成分，靶點與疾病的生物信息學綜合網絡構建，初步探究了該藥治療心律失常的可能作用機制。

健心膠囊由黃芪和苦參組方而成。現代藥理研究發現，黃芪具有抗氧化，抗炎，免疫調節，抗腫瘤，降血脂，降血糖和利尿作用［21?22］。在心血管系統保護方面，黃芪具有保護心肌、改善心肌缺血、抑制心肌肥厚、抑制心肌纖維化、保護血管內皮細胞、促進血管生成、抑制血管平滑肌細胞增殖、抑制心肌重構及抗心律失常等保護心臟作用［23?24］。苦參具有抗病毒、抗炎、消腫利尿、抗腫瘤作用，同時抗心律失常、調節免疫作用，廣泛用于心律失常、心力衰竭、病毒性心肌炎、冠心病等作用［25?26］。

本研究篩選得到健心膠囊中41 個具有治療心律失常靶點的化合物，部分成分的有效性已被證實。MOL000098 槲皮素是一種具有多種生物活性的化合物，具有抗氧化、抗炎、降糖，保護心臟等多種作用［27］。槲皮素能降低心肌細胞的自律性、延長不應期、保護心肌細胞膜上的Na＋?K＋?ATP 酶、拮抗外鈣內流等直接抗心律失常作用［28］。山柰酚屬于黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、預防心血管疾病等多種藥理活性［29］。木犀草素是黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、免疫調節、血管生成及神經保護作用等多種作用［30］。在缺血／再灌注損傷的糖尿病大鼠模型中，木犀草素可保留心臟功能，減少梗死面積和心肌細胞凋亡，降低心律失常的發生率［31］。芒柄花黃素具有抗氧化應激，抗炎作用［32］，并具有調節體內血脂代謝和預防動脈粥樣硬化的作用［33］，發揮保護心臟作用。

蛋白相互作用網絡圖表明健心膠囊治療心律失常的靶蛋白之間存在著相互關系，是一個復雜交錯的網絡，并非單獨發揮作用。分析網絡，篩選得到的NOS3、IL6、SLC6A4、PTGS2、CXCR4、GJA1、PRKCA、ADRA1B、MMP3，這些核心靶點均與心肌細胞代謝、心電活動、血流灌注等顯著相關，均被大量的實驗研究論證，可能是健心膠囊治療心律失常的重要作用靶點。

一氧化氮合酶（NOS）是唯一能限制左旋精氨酸生成一氧化氮的合成酶，它的變化直接影響著一氧化氮的生成及發揮的作用。一氧化氮是內皮依賴的血管舒張因子，具有舒張血管、調節血壓、抑制血小板聚集與黏附、抑制血管平滑肌細胞增生、防止脂蛋白氧化等生物學作用［34］，在心律失常中作為內源性心臟保護因子［35］。白細胞介素6（IL?6）由纖維母細胞、單核／巨噬細胞等產生，作用于血管系統，促進血管內皮細胞表達黏附分子和其他炎癥遞質，增強局部炎癥反應。研究表明，心房顫動患者中炎癥介質IL?6 水平顯著上升，心房收縮受損可促進炎癥前的改變，IL?6 的水平已被認為是高危房顫患者中風和死亡、異常炎癥與血栓栓塞的獨立預測因素［36］。縫隙連接蛋白43（CJA1）是相鄰細胞間形成縫隙連接，允許離子之間跨細胞互相流動，是動作電位更加協調的基礎，可編碼Cx43 基因，Cx43 功能缺陷是房顫等心律失常發生的原因之一［37］。α1B?腎上腺素受體（ADRA1B）屬于G 蛋白偶聯受體超家族成員，是去甲腎上腺素的主要靶受體，能夠激活多項下游的信號轉導起到預防心力衰竭條件下心臟病理性重塑的作用。并能激活細胞內信號轉導路徑，減少鈣離子流，顯著延長動作電位時間，導致心律失常［38］。基質金屬蛋白酶3（MMP3）是一種在細胞外基質降解及再塑中發揮重要作用的鋅離子依賴的中性蛋白酶，其在動脈粥樣硬化、及心肌重構過程中發揮著重要作用［39］。這些進一步說明本研究測得的結果的可靠性和科學性。

另外，健心膠囊候選作用心律失常靶基因KEGG 通路的顯著富集通路涉及cGMP?PKG 信號通路、VEGF 信號通路、心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導、唾液分泌、鈣離子信號通路、血管平滑肌收縮通路。目前研究表明，cGMP?PKG 信號通路具有增強心臟收縮力，抑制肥大和影響細胞重塑作用，可通過PDEs 信號通路調節cAMP 信號通路，發揮保護心肌作用［40］。VEGF 由血管內皮細胞分泌，是最關鍵的血管生成促進因子，在生理性和病理性血管新生過程中發揮著重要作用，可增加微血管與小靜脈血管的通透性，促進血管新生，從而改善心肌缺氧，緩解心絞痛［41］。鈣離子通道是心臟電活動、機械偶聯調控及維持心臟正常節律的中心環節，Ca2＋的失調控是收縮失能和心律失常的主要原因［42］。

通過上述分析，本研究預測健心膠囊治療心律失常的作用機制，可能是通過調控健心膠囊?心律失常交接靶基因的表達，改善心肌細胞代謝、心電活動、血流灌注等，調節下游cGMP?PKG 信號、VEGF 信號、心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導、鈣離子信號、血管平滑肌收縮等通路，達到治療心律失常的目的。

綜上所述，本研究借助網絡藥理學的相關數據庫信息，對健心膠囊治療心律失常作用機制進行了系統分析。結果證實了中藥治療疾病的多成分、多靶點、多通路特點，并為健心膠囊的進一步實驗研究和臨床應用提供了新思路和指明了新方向，同時也為中醫藥的研究提供了新方法和新思路。但是，由于機體連續性和整體性的生物學特點，網絡藥理學分析存在數據庫和已有實驗數據構成的網絡模型局限性，其雖能系統地預測藥物化學成分作用的靶點，但無法預測靶點的上調和下調，從而預測功能改變的方向，此外也存在藥物代謝動力學方面的問題，如靶點在細胞內時空分布的實際問題等，不能揭示完整的藥理作用。因此，分析結果需要開展相應的體內外實驗加以驗證，以期更加全面地闡釋中醫藥治療疾病多成分、多靶點、多通路的機制。