薄荷潤唇膏微生物指示菌挑戰性試驗研究*

滕寶霞,牟建平,賀曉文

(甘肅省藥品檢驗研究院,甘肅 蘭州 730070)

薄荷潤唇膏主要成分為：礦油、地蠟、礦脂、甲氧基肉桂酸乙基乙酯、水楊酸乙基乙酯、羊毛脂、薄荷醇、樟腦、藍桉葉油、歐洲赤松葉油、水楊酸甲酯。由于含有大量油、酯類物質，按化妝品微生物檢驗[1]中常規的檢驗方法，制備的供試液不能形成均勻的混懸液，薄荷潤唇膏中含有薄荷醇[2]、水楊酸乙基乙酯成分[3]，對部分質控菌有一定的抑制作用。進行指示菌挑戰性試驗，通過計數方法回收率、控制菌生長試驗，建立薄荷潤唇膏微生物檢驗方法。

1 試驗材料

1.1 薄荷潤唇膏

曼秀蕾敦(中國)藥業有限公司，生產許可證號：XK16-108 1377，衛妝準字29-XK-0649 ，國妝特字G20100002，有效期：2020年10月。

1.2 培養基

卵磷脂吐溫80營養瓊脂，批號：190221；SCDLP液體培養基，批號：180202；孟加拉紅瓊脂，批號：180119；雙倍乳糖膽鹽培養基(含中和劑)，批號：180609；Baird-Parker培養基，批號：190122；甘露醇發酵培養基，批號：180811；伊紅美藍瓊脂(EMB)，批號：190827；十六烷三甲基溴化銨瓊脂，批號：190813；pH7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液，批號：20200312。均購于北京陸橋技術股份有限公司。

1.3 菌種

大腸埃希菌〔ATCC8739〕、銅綠假單胞菌〔ATCC 27853〕、枯草芽孢桿菌〔ATCC 6633〕、金黃色葡萄球菌〔ATCC6538〕、白色念珠菌〔ATCC10231〕和黑曲霉〔ATCC16404〕。購于中國食品藥品檢驗研究院。

1.4 設備

超凈工作臺(廠家：蘇州蘇凈、型號：SW-CJ-2D型)、生物安全柜(廠家：ESCD、型號：CLASS11BSC)、生化培養箱(廠家：上海一恒、型號：BPMJ-250F)、壓力消毒器(廠家：松下、型號：MSL-3781L-PC)、恒溫水浴鍋(廠家：杭州米歐儀器有限公司、型號：WT100-2)、電冰箱(廠家：江蘇白雪、型號：6C13080177)、顯微鏡(廠家：奧林巴斯、型號：BX53+DP74)、電熱恒溫干燥箱(廠家：北京科偉永興儀器有限公司、型號：101-3AB)、天平(廠家：諸暨超澤、型號：JMA5001)。

2 方法與結果

2.1 菌種

試驗所用菌種為第3代，菌懸液為第4代。

2.2 供試液制備

取薄荷潤唇膏 5 g 加到滅菌的三角瓶中，加入 5 mL 滅菌吐溫-80，加入pH7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液至 100 mL,置于 45 ℃ 水浴中，溶解，用勻漿儀混勻3 min，制成1∶20 g/mL供試液。

2.3 計數方法試驗(1)

1)試驗組取1∶20 g/mL供試液，分別加入5種試驗菌株(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉)的菌懸液，制成含菌數小于 100 cfu 的供試液，取含菌的樣品溶液 1 mL，每個菌液注2個平皿，注入所需培養基，培養、計數。

2)菌液對照組分別取5種實驗菌的菌懸液(50～100cfu)1 mL 注皿，加培養基、培養、計數。

3)供試品對照組用供試品替代實驗組液體注皿，實驗。

4)陰性對照組用同批配制、滅菌的SCDLP 1 mL 替代樣品注皿，注入培養基、培養、計數。計數方法試驗(1)的結果見表1。

表1 薄荷潤唇膏計數方法(1)挑戰性試驗

結果，采用1∶20 g/mL的供試液 1 mL 注皿，金黃色葡萄球菌的回收率小于50%，方法不可行。

2.4 計數方法試驗(2)

將供試液1∶20 g/mL稀釋成1∶50 g/mL和1∶100 g/mL，加入金黃色葡萄球菌的菌懸液，進行挑戰性試驗。計數方法試驗(2)的結果見表2。

表2 薄荷潤唇膏計數方法(2)挑戰性試驗

結果，細菌總數采用1∶50 g/mL的供試液 1 mL 注皿，霉菌和酵母菌總數采用1∶20 g/mL的供試液 1 mL 注皿，回收率試驗滿足指示菌挑戰性試驗要求，檢驗方法可行。

2.5 銅綠假單胞菌檢驗方法挑戰性試驗

1)試驗組。取薄荷潤唇膏 1∶20 g/mL的供試液 20 mL 加入 100 mL SCDLP液體培養基到滅菌的三角瓶中，加入銅綠假單胞菌菌懸液 1 mL(小于 100 cfu)，按《化妝品安全技術規范》2015年版的要求進行試驗。

2)陽性對照。 將銅綠假單胞菌菌懸液 1 mL(小于 100 cfu)加到 100 mL SCDLP液體培養基，按《化妝品安全技術規范》2015年版的要求進行檢驗；同時測定銅綠假單胞菌菌懸液菌數。

3)供試品對照組。取薄荷潤唇膏1∶20 g/mL的供試液 20 mL 加入 100 mL SCDLP液體培養基到滅菌的三角瓶中，按《化妝品安全技術規范》2015年版的要求進行試驗。

4)陰性對照。同批配制、滅菌， 100 mL SCDLP液體培養基，按《化妝品安全技術規范》2015年版的要求進行檢驗。

銅綠假單胞菌方法適用性試驗結果，見表3

表3 薄荷潤唇膏——銅綠假單胞菌方法適用性試驗

結果表明，采用《化妝品安全技術規范》2015年版銅綠假單胞菌常規方法進行試驗，可以檢出試驗菌-銅綠假單胞菌，方法可行。

2.6 金黃色葡萄球菌檢驗方法挑戰性試驗

2.6.1 常規方法

1)試驗組。取薄荷潤唇膏1∶20 g/mL的供試液 20 mL 加入 100 mL SCDLP液體培養基到滅菌的三角瓶中，加入金黃色葡萄球菌菌懸液 1 mL(小于100 cfu)，按《化妝品安全技術規范》2015年版金黃色葡萄球菌檢查項進行試驗。

2)陽性對照將金黃色葡萄球菌菌懸液 1 mL(小于 100 cfu)加到 100 mL SCDLP液體培養基，按《化妝品安全技術規范》2015年版的要求進行檢驗；同時測定金黃色葡萄球菌菌懸液菌數。

3)供試品對照組取薄荷潤唇膏1∶20 g/mL的供試液 20 mL 加入 100 mL SCDLP液體培養基到滅菌的三角瓶中， 按《化妝品安全技術規范》2015年版的要求進行試驗。

4)陰性對照同批配制、滅菌 100 mL SCDLP液體培養基，按《化妝品安全技術規范》2015年版的要求進行檢驗。

金黃色葡萄球菌方法適用性試驗(常規法)結果，見表4。

表4 薄荷潤唇膏控制菌——金黃色葡萄球菌方法適用性試驗(常規法)

結果表明，采用《化妝品安全技術規范》2015年版金黃色葡萄球菌的常規方法進行試驗，未檢出試驗菌-金黃色葡萄球菌，方法不可行。

2.6.2 培養基稀釋方法

試驗組、陽性對照、供試品對照組和陰性對照組SCDLP液體培養基的體積采用 300 mL 進行金黃色葡萄球菌 的生長實驗，結果見表5。

表5 薄荷潤唇膏控制菌——金黃色葡萄球菌方法適用性試驗(培養基稀釋法)

結果表明，參照《化妝品安全技術規范》2015年版和《中國藥典》2015年版1106金黃色葡萄球菌檢驗方法，增加培養基體積，進行挑戰性實驗，檢出試驗菌-金黃色葡萄球菌，方法可行。

2.7 耐熱大腸菌群檢驗方法挑戰性試驗

1)試驗組。取薄荷潤唇膏1∶20 g/mL的供試液 20 mL 加入 20 mL 雙倍乳糖膽鹽培養基(含中和劑)到滅菌的試管中，加入大腸埃希菌菌懸液 1 mL(小于 100 cfu)，按《化妝品安全技術規范》2015年版耐熱大腸菌群檢查項進行試驗。

2)陽性對照。將大腸埃希菌菌懸液 1 mL(小于100 cfu)加到 20 mL 雙倍乳糖膽鹽培養基(含中和劑)，按《化妝品安全技術規范》2015年版的要求進行檢驗；同時測定大腸埃希菌菌懸液菌數。

3)供試品對照組。取薄荷潤唇膏1∶20 g/mL的供試液 20 mL 加入 20 mL 雙倍乳糖膽鹽培養基(含中和劑)到滅菌的試管中，按《化妝品安全技術規范》2015年版的要求進行試驗。

4)陰性對照。同批配制、滅菌 20 mL 雙倍乳糖膽鹽培養基(含中和劑)，按《化妝品安全技術規范》2015年版的要求進行檢驗。

耐熱大腸菌群方法適用性試驗結果，見表6。

表6 薄荷潤唇膏控制菌-耐熱大腸菌群方法適用性試驗

結果表明，采用《化妝品安全技術規范》2015年版耐熱大腸菌群的常規方法進行試驗，可以檢出試驗菌-大腸埃希菌，方法可行。

3 結論

1)薄荷潤唇膏由于含有大量脂溶性基質，不易制備成均勻的混懸液。由于薄荷潤唇膏對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，細菌采用 1∶50 g/mL的供試液注皿，真菌采用1∶20 g/mL 的供試液注皿，試驗回收率達到 70%以上，挑戰性試驗成功，檢驗方法可行。

2)按規范方法，進行指示菌挑戰性試驗，控制菌滿足要求，金黃色葡萄球菌采用培養基稀釋方法，可以通過挑戰性試驗，表明檢驗方法可行。