2,4-二硝基苯肼衍生化共振散射光譜法測定丙二醛*

鄭春連，黃勝銀，張迎春，羅景鵬，凌紹明

(百色學院化學與環境工程學院，廣西 百色 533000)

丙二醛(MDA)是脂質過氧化物代謝產生的一種物質，該物質具有很高的生物活性，能夠與DNA、蛋白酶、膜蛋白等結合，產生細胞毒害作用[1]。在研究動植物的生理毒性時，通常以MDA的含量高低作為評價細胞膜系統受損害程度的重要指標[2]。在糧油安全評價中，MDA是衡量食品或油脂脂質過氧化程度的標志物。研究表明，掛面、食用油、肉制品或腌制品中有MDA存在[3-5]，食用MDA含量高的食品會對人體多種器官產生危害。可見，建立一種準確、快速測定MDA方法，對于快速判斷食品的品質以及在研究動植物體內細胞膜系統損害程度和藥物(或毒物)的藥理(毒理)作用有重要的意義。目前，測定MDA的方法主要有高效液相色譜法[6-7]、液相色譜-質譜法[8]、氣相色譜-質譜法[9]、分光光度法[10]、熒光法[11]和表面增強拉曼散射光譜法[12]等。色譜法檢出限低、靈敏度高，但是檢測成本高、操作繁瑣；表面增強拉曼光譜法檢出限低、靈敏度高，但是SERS基底的穩定性較差，重現性不好；分光光度法操作簡單，但靈敏度不高；共振散射光譜法是20世紀90年代發展起來的一種檢測速度快、靈敏度高的分析技術，在金屬離子、蛋白質、核酸檢測上取得較好的效果[13-14]。研究發現，在pH 3.8醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，丙二醛(MDA)與2,4-二硝基苯肼(DNPH)發生反應生成疏水性的苯腙，導致體系產生共振散射效應，據此建立一種檢測MDA含量的共振散射光譜分析方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1.0 mg/mL 丙二醛(MDA)儲備液：用移液槍移取 231 μL 的1,1,3,3-四甲氧基丙烷溶于適量超純水，定容于 100 mL 棕色容量瓶中，4 ℃ 冰箱保存備用。25 μg/mL 丙二醛標準工作液：用移液槍移取 2500 μL 1.0 mg/mL 丙二醛儲備液于 100 mL 棕色容量瓶，用超純水定容至刻度。2,4-二硝基苯肼(DNPH)稀乙醇溶液：在 15 mL 濃硫酸中，溶解 3.0 g 2,4-二硝基苯肼，另在 70 mL 95%乙醇中加入 20 mL 水，然后把硫酸苯肼倒入稀乙醇溶液中，混合均勻，如有沉淀過濾備用。不同pH值醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(BS)：由 0.10 mol/L 醋酸水溶液和 0.10 mol/L 醋酸鈉水溶液按一定比例混合而得。

F-7000型熒光分光光度計，日本日立公司；TST-UPB-20型超純水器，石家莊泰斯特儀器設備有限公司；AE240型電子分析天平，上海梅特勒-托利多有限公司；KG-200KDB型數控超聲波清洗器，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

在5.0 mL具塞比色管中依次加入pH3.8醋酸-醋酸鈉緩沖溶液 450 μL、適量丙二醛標準工作液、2,4-二硝基苯肼稀乙醇溶液 500 μL，用水定容至 5.0 mL。在 50 ℃ 水浴中加熱 40 min，取出流水冷卻 3 min。用熒光分光光度計進行同步掃描(EX Slit=EM Slit=5.0 nm，PM Volt=500 V)得共振散射光譜圖。計算 438 nm 處的ΔI=I-I0。

2 結果與討論

2.1 共振散射光譜圖

1,1,3,3-四甲氧基丙烷在酸性條件下分解為MDA。由圖1可見，緩沖溶液-2,4-二硝基苯肼體系的共振散射強度較弱，當有MDA存在時，MDA與2,4-二硝基苯肼發生化學反應生成疏水性的苯腙，導致體系發生共振散射效應，其中 451 nm、493 nm 處信號較強。實驗選擇 451 nm 處作為測量波長。

圖1 共振散射光譜圖

HAc-NaAc緩沖溶液(pH3.8)450 μL，2,4-二硝基苯肼乙醇溶液 500 μL，t=40 min，T=50 ℃。

2.2 檢測條件選擇

2.2.1 選擇緩沖溶液pH值及用量

實驗考察不同緩沖溶液pH值(3.2、3.5、3.8、4.4、5.0、5.6)對ΔI的影響。結果發現：緩沖溶液pH值為3.8時，體系的ΔI較大而且穩定，故實驗取緩沖溶液pH值為3.8。按照實驗方法考察緩沖溶液用量影響。結果顯示：隨著醋酸-醋酸鈉緩沖溶液用量增加，體系的ΔI逐漸加大，當醋酸-醋酸鈉緩沖溶液用量為 450 μL 時體系的ΔI較大。實驗選擇醋酸-醋酸鈉緩沖溶液用量為 450 μL。

2.2.2 選擇DNPH乙醇溶液用量

實驗考察衍生化試劑DNPH乙醇溶液用量影響。結果顯示：隨著DNPH用量的增加，體系ΔI逐漸增大，當DNPH用量大于 500 μL 時，ΔI隨著DNPH用量增加而迅速減少。這可能是增加DNPH用量，體系的空白值增大所致。實驗選取DNPH用量為 500 μL。

2.2.3 選擇反應時間

實驗考察反應時間對ΔI的影響。結果顯示：隨著反應時間的增加，體系ΔI增大，當反應時間大于 40 min 時，體系的ΔI緩慢減少。實驗選取反應時間為 40 min。

2.2.4 選擇反應溫度

實驗考察反應溫度對ΔI的影響。結果顯示：反應溫度對體系的ΔI影響較為顯著。反應溫度較低時，反應速度慢，體系生成的苯腙微粒數量少，共振散射信號較弱；隨著反應溫度的增大，反應速度加快，體系生成的苯腙微粒數量增加，共振散射信號強度增強，ΔI逐漸增大；當反應溫度為 50 ℃ 時，ΔI達到最大值。反應溫度大于 50 ℃ 以后，體系的ΔI逐漸減小，這可能是體系溫度較高時副反應增多所致。

2.3 線性回歸方程與檢出限

移取0、15、50、75、150、200、300、500 μL MDA標準溶液，按照1.2實驗方法測定體系的共振散射強度I值，以ΔI為縱坐標，MDA的質量濃度為橫坐標，繪制方法的標準工作曲線。方法的線性回歸方程為ΔI=68.631+860.13ρ(ρ單位：μg/mL)，線性范圍為0.075～2.5 μg/mL，相關系數(R2)為0.9929，檢出限(3S/K)為 0.025 μg/mL。

2.4 干擾實驗

2.5 樣品測定

按照文獻[15]的方法對樣品進行處理。稱取大豆油或豬油各 100 g，加入三氯乙酸-EDTA混合溶液 100 mL(其中，三氯乙酸的質量濃度為 75 g/L，EDTA的質量濃度為 1.0 g/L)，攪拌 30 min，轉入分液漏斗進行分離，將提取液轉入旋轉蒸發器內,在 60 ℃ 左右旋轉蒸發至剩余的殘留液約為 50 mL 時停止蒸發，冷卻，將殘留物轉移到 100 mL 容量瓶，用超純水定容至刻度，4～6 ℃ 冰箱保存備用。

取約 10 mL 待測液過 0.45 μm 濾膜，再取適量濾液按照1.2實驗方法測定MDA含量并做加標回收實驗，結果見表1。

表1 豬油、大豆油中MDA含量及加標實驗結果 (n=5)

由表1可見，本法的測定值與UV/VIS法[16](2010)的測定結果相吻合。

3 結論

在pH3.8醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，MDA與DNPH發生親核加成反應生成疏水性的苯腙而導致體系的共振散射信號增強，其中 451 nm、493 nm 處信號較強(實驗取 451 nm 為測定波長)，據此建立了一種共振散射光譜檢測MDA含量法，方法的線性回歸方程為ΔI=68.631+860.13ρ(ρ單位：μg/mL)，線性范圍為0.075～2.5 μg/mL，相關系數(R2)為0.9929，檢出限(3S/K)為 0.025 μg/mL。將本法應用于豬油和大豆油中MDA含量測定，測定結果的RSD在2.3%～3.1%，回收率在97.2%～108%。