有機肥料糞大腸菌群指標檢測時效性初探

王 洹,姚 莎,何 蓉,陳 萌

(云南省化工研究院有限公司，云南 昆明 650228)

糞大腸菌群是反映堆肥在發酵過程中是否完全腐熟的指標之一。目前在有機肥、有機-無機復混肥、生物有機肥、復合微生物肥料、農用微生物菌劑等肥料檢測中，都會涉及到糞大腸菌群這個指標。糞大腸菌群(Fecd Coliform)是總大腸菌群的一部分，主要來自糞便[1]，是一群在44.5±0.5 ℃ 的條件下能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。

中華人民共和國國家標準GB/T 19524.1-2004《肥料中糞大腸菌群的測定》[2]中明確規定肥料中的糞大腸菌群最大可能數(MPN)要小于等于100。糞大腸菌群數的高低是衡量肥料腐熟程度的重要體現指標，是堆肥能否有效殺死和消除肥料中所含的病原菌、寄生蟲卵等有害物質[3]的依據。研究表明，施入農田肥料帶入的糞大腸菌群，在土壤中可能會長期存活，并能進入作物體內，最終影響人體健康(尤其是老人和孩童)及農業環境，嚴重污染可能會引起流行疾病的發生[4]。

本實驗室在日常委檢樣品檢測-復檢的過程中發現，肥料中的糞大腸菌群數會隨著樣品儲存時間的加長出現下降的態勢。這與葉小梅[5]在畜禽糞便自然堆放及施入農田后糞大腸菌群數量的消長研究結果相符(自然堆放的條件下，冬季和夏季糞便中糞大腸菌群數量在放置期間呈下降趨勢)。中華人民共和國農業行業標準NY 525-2012《有機肥料》標準[6]中提到“經四分法縮分后的樣品保存至少2個月，以備查用”，但在實際檢驗中發現，保存1個月以后的樣品檢驗結果有時會與第一次檢驗的結果存在差異。為探究保存時間和保存條件對糞大腸菌群數指標檢測結果的影響，進一步確定肥料樣品最佳檢測時間，特設計如下試驗方案，以期在肥料樣品檢測時效性方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

實驗中所涉及的10份樣品，隨機取自日常委檢糞大腸菌群數指標不合格的樣品。在無菌條件下將其分成兩等份，1份常溫保存，1份 4 ℃ 保存，每間隔一個月進行一次糞大腸菌群檢測。

1.2 試劑

乳糖膽鹽發酵培養基(生產批號：1075661)、伊紅美藍瓊脂培養基(生產批號：1065911)和革蘭氏染色液(生產批號：6105079)、乳糖發酵培養基(生產批號：1070521)，均購買自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.3 儀器設備

電子天平、試管、三角瓶、壓力蒸汽滅菌器、電熱鼓風干燥箱、恒溫振蕩器、潔凈工作臺、滅菌槍頭、隔水式培養箱、顯微鏡、滅菌培養皿。

1.4 檢測流程

采用多管發酵法，按照國家標準GB/T19524.1-2004《肥料中糞大腸菌群的測定》進行試驗，通過乳糖膽鹽發酵試驗、平板分離、乳糖發酵試驗觀察產酸產氣情況，按陽性發酵管數查MPN表，確定每克(毫升)肥料樣品中的的糞大腸菌群數。

2 結果及分析

2.1 初始檢測結果統計

表1中統計了隨機抽取的10份糞大腸菌群數指標不合格樣品糞大腸菌群數檢測結果。

由表1可知，10份隨機選出的肥料樣品，初始檢測結果顯示，糞大腸菌群數均>1100，遠超于標準中的規定限值(≤100)。這表明在肥料發酵腐熟過程中，糞大腸菌群沒有被殺死，這樣的肥料被農戶施用到農田中，其中的糞大腸菌群就會感染到農作物上，影響農產品，尤其是蔬菜的衛生質量，進而影響人體健康。

表1 肥料鮮樣檢測結果統計

2.2 儲存時間對檢測結果的影響

將10份樣品保存于常溫、4 ℃ 條件下1個月和2個月后，檢測糞大腸菌群指標結果如表2。

由表2 可知，隨著肥料樣品儲存時間的增加，除樣品1和樣品7中的糞大腸菌群數未發生變化外，其余樣品均有明顯下降趨勢，其中的5份樣品在儲存2個月之后檢測結果發生顯著變化，產品質量判定由不合格變成合格。初步推測糞大腸菌群數下降趨勢不一，可能與肥料的組成成分有關。有的基質營養豐富，能較長時間為其中的糞大腸菌群提供生命物質，所以試驗結果沒有發生明顯變化；有的肥料樣品則變化巨大(不合格轉變成合格)，可能是因為該樣品中的菌群所需營養物質相對較少，或者是樣品的理化性質發生改變，以及有機肥料自身繼續腐熟等情況，無法長期為糞大腸菌群提供生命物質，導致菌群無法長期生存。

表2 不同保存條件下糞大腸菌群數對比

從表2中還可知，保存條件(常溫或 4 ℃)對樣品中的糞大腸菌群變化的影響明顯不同，絕大多數常溫儲存的樣品中糞大腸菌下降迅速，而低溫冷藏的樣品則能夠減緩糞大腸菌下降的速度，但不能完全抑制。原因可能是在常溫條件下菌群較為活躍，消耗營養物質速度較快，保存時間較長，營養跟不上，導致菌群數下降迅速。而低溫保存的樣品菌群活躍度低，對營養物質的消耗相對較慢，因此菌群數下降速度減緩。但常溫保存和低溫保存都無法完全抑制菌群的生命活動，營養物質持續減少，因此兩種保存條件下都無法完全抑制菌群數下降的趨勢。

從本次實驗結果可知，相較而言，肥料樣品在糞大腸菌群檢測期間最好能夠低溫冷藏儲存。同時，肥料樣品中的糞大腸菌群檢測具有時效性，在實際檢測中合理安排試驗時間，新鮮的肥料來樣最好在極短的時間內完成檢測，避免樣品自身屬性發生改變，致使結果發生偏差，不能反映有機肥料樣品的真實情況，無法給企業生產者提供有價值的參考。

2.3 兩種儲存條件下糞大腸菌群數量變化

由圖1和圖2可知，不論是常溫還是 4 ℃ 儲存，10份隨機選出的肥料樣品，隨著時間推移，80%的試樣中糞大腸菌群數量發生不同程度的下降，總體呈現出下降趨勢。間隔1個月復檢，4 ℃ 儲存的樣品中糞大腸菌群變化幅度明顯小于常溫儲存的，再次表明肥料樣品可短時間低溫冷藏待檢。間隔2個月以后再對樣品進行復檢，發現兩種方式儲存的樣品中糞大腸菌群數變化非常大，不能重現初檢和第一次復檢的結果。

圖1 常溫條件下糞大腸菌群的變化

圖2 4 ℃條件下糞大腸菌群的變化

3 小結

研究發現，肥料中的糞大腸菌群數量隨著時間推移，大部分樣品呈現下降的趨勢。為了能夠客觀的評價肥料品質，從生產企業送樣，到檢測機構制樣、檢測，整個過程能快則快(建議一周之內完成)。檢驗機構可通過空白樣品及插入質控樣品保證初檢結果的準確性。若檢測機構遇到間隔時間較長、需要復檢的有機肥料樣品時需特別注意。

研究還發現，跨時間段對肥料樣品中糞大腸菌群數進行復檢，檢測結果不能復現，出具的復檢報告可能并不能真實反應當時有機肥料樣品的實際情況，提出復檢的生產企業應嚴肅考慮產品的時效性，以避免對農民造成損失。