二氯乙酸鈉在豬精液冷凍保存中的應用效果

楊寶衛(wèi) ，周運和 ，陳祥林 ，李彩萍 ，胡傳活

（1.廣西水產(chǎn)畜牧學校，廣西 南寧 530021；2.廣西大學動物科技學院，廣西 南寧 530005）

自從1956年Polge[1]等開始進行豬精液冷凍試驗后，很多國家都相繼開展了該項技術的研究。但是，豬精子對外界溫度變化比較敏感，冷凍、解凍過程中極易受到損傷，導致豬凍精生產(chǎn)難度大。經(jīng)過幾十年的不懈研究和改良，雖然凍精生產(chǎn)的技術已有很大的進步，但凍后精液的受胎率、窩產(chǎn)仔數(shù)還是不如常溫液態(tài)精液好。目前全球利用豬凍精進行人工授精的比例不到人工授精總數(shù)的1%[2]。

二氯乙酸鈉（DCA）在豬精液保存中的應用研究較少，因此本研究在傳統(tǒng)稀釋液的基礎上添加了DCA，以分析此種試劑對豬精子凍后質(zhì)量的改善有無作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設備 N-乙酰半胱氨酸（NAC）、MLT購自Sigma公司，DCA購自武漢一化工有限公司，三羥甲基氨基甲烷（Tris）由Amersco公司分裝，新鮮精液由廣西科達畜禽改良有限責任公司提供；自動化精液冷凍儀由法國IMV卡蘇科技股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗步驟

1.2.1 精液采集、稀釋與平衡 用手握法采精，選用精子活力60%以上的精液。將精液放入離心機內(nèi)，以2000r/min離心5min。去掉適量上清液，吹打均勻，待用。用試管取離心后的精液適量，按1∶1比例分兩次（間隔15min）加入冷凍稀釋液（配方見表1，參考李剛等[3]及魏世寶[4]的資料來配制），吹打均勻，用0.25mL塑料細管分裝，作好標記，放入冰箱中5℃下平衡4h。

表1 豬精液冷凍稀釋液配方

1.2.2 精液的冷凍與解凍 將細管取出，檢查平衡后活力，放入精子程序降溫儀內(nèi)冷凍：開始溫度為5℃，降至-5℃的降溫時間約為3.8 min，降溫速度約為2.6℃/min；從-5℃下降至終止溫度-134℃的降溫時間約為5.2min，降溫速度約為24.8℃/min；程序運行結束后，馬上將細管投入液氮。至少5min之后，將細管放入電子恒溫水浴鍋內(nèi)解凍（40℃，4～6s），鏡檢。

1.2.3 精子的畸形率、頂體完整率檢查 參照江一平等[5]報道的方法用考馬斯亮藍R250染色液對精子進行染色，然后在1000×顯微鏡下檢查精子畸形率和頂體完整率。每個處理抹片2張，每片記數(shù)200個以上的精子。

1.3 試驗設計 按二氯乙酸鈉（DCA）在稀釋液中的濃度分為 0、1、0.1、0.01mmol/L 4 組，試驗重復 5 次。檢測指標為凍后精子的畸形率及頂體完整率。

1.4 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)用Excel軟件進行處理，然后用SPSS13.0軟件ANOVA法進行方差分析，用Duncan法進行多重比較，檢驗差異的顯著性。

2 結果與分析

從表2可見，當DCA濃度為1 mmol/L時，凍后精子的畸形率和頂體完整率與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；當DCA濃度降低時，這兩個指標顯著差于對照組（P＜0.05）。說明在冷凍稀釋液中添加DCA對凍后精子的畸形率和頂體完整率沒有改善作用。

表2 二氯乙酸鈉對凍后精子的畸形率和頂體完整率的影響

3 討論與結論

3.1 DCA的作用 近來有研究發(fā)現(xiàn)，DCA作為一種廉價的用于治療新陳代謝紊亂的藥物，可以殺死癌細胞并對腫瘤的生長有一定的抑制作用，還可通過促進乳酸氧化、降低血液乳酸水平、改善機體的代謝平衡來治療一些代謝性疾病，如先天性或代償性乳酸酸中毒。在組織缺氧情況下（比如激烈運動造成的組織缺氧及高乳酸水平），DCA可通過增加氧攝取、激活丙酮酸脫氫酶復合物，促進乳酸氧化來補充能量供應，從而改善缺氧組織的能量代謝狀況。目前已經(jīng)作為藥物進行研究的二氯乙酸鹽，包括其鈉鹽、二異丙胺鹽、二氯乙酸酯和離子化合物，用于臨床的只有DCA。已報道的二氯乙酸鹽代謝產(chǎn)物包括：乙氯乙酸、乙醛酸、乙醇酸、乙二酸、二氧化碳和甘氨酸。

臨床研究顯示，與碳酸氫鈉相比，DCA不但能夠緩解酸中毒，而且能夠改善血液動力學指標，降低外周血管阻力，并對腦出血有保護作用。DCA還能提高氧的利用度，毒副作用的發(fā)生率不高。在已經(jīng)進行的各項臨床試驗中，不管使用DCA的劑量大小或時間長短，均未見有關致癌、致突變的報道。正常細胞的能量供給主要來自于葡萄糖代謝，通過線粒體依賴的糖氧化和糖酵解兩種方式供應三磷酸腺苷。惡性腫瘤細胞在氧充足的條件下，糖酵解代謝同樣非常活躍，腫瘤細胞可以從活躍的糖酵解代謝中獲益[7]。糖酵解過程可產(chǎn)生大量乳酸，導致腫瘤細胞微環(huán)境酸化，酸化的微環(huán)境對腫瘤細胞可能造成生長抑制，但腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個不斷變異選擇的過程，當耐酸的腫瘤細胞株優(yōu)勢選擇形成，酸化的微環(huán)境則對腫瘤細胞有著保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，糖酵解酶具有拮抗細胞凋亡的功效，可導致惡性腫瘤對化療和放療等促凋亡作用的耐受。如己糖激酶能與線粒體特異結合，發(fā)揮生物學作用，激活的己糖激酶從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜，與線粒體膜交互作用，抑制了一些線粒體依賴的細胞凋亡的關鍵部分，從而增加細胞對凋亡的抵抗。近來有研究表明，這種過多的糖酵解很可能造成細胞對凋亡的抵抗。

3.2 作用機理 DCA為丙酮酸脫氫酶激酶抑制劑，由于抑制作用，使更多的丙酮酸進入線粒體，增加正常的線粒體氧化，抑制了糖酵解。線粒體的重構會引起線粒體氧化磷酸化過程的損傷，可導致糖酵解代謝增高。其機制可能是線粒體中存在一些促細胞凋亡的介質(zhì)，當線粒體轉(zhuǎn)運孔打開時，這些因子就會釋放到細胞質(zhì)中誘導凋亡。線粒體的去極化以及ROS的增加可能會造成線粒體的重構，抑制MTP開放，使凋亡誘導因子不能釋放，最終導致對細胞凋亡的抵抗。線粒體還能調(diào)節(jié)一些重要的鉀離子、鈣離子等離子通道，如一些腫瘤細胞中的Kv通道因為線粒體的重構而受到抑制，如果Kv通道被抑制，就可能造成細胞對凋亡的抵抗。已有研究表明，DCA可以降低線粒體膜電位，增加線粒體的過氧化氫，激活腫瘤細胞中的Kv通道，且不影響正常細胞，進一步介導細胞凋亡，抑制腫瘤生長。

徐靜等研究表明，DCA對缺氧復氧損傷引起的肥大心肌細胞的凋亡具有抑制作用。通過觀察心肌細胞凋亡形態(tài)學特征并檢測心肌細胞凋亡率，結果得出10-3mmol/L DCA在缺氧和復氧情況下相同時間內(nèi)的凋亡率較其他組及對照組顯著低，鑒于此理論基礎上我們把DCA添加到冷凍稀釋液中看是否對精子同樣具有抗凋亡作用。

3.3 結論 本試驗中凍后精子的畸形率和頂體完整率基本與徐靜等研究的結果相符，其具體的作用機制尚不清楚，需要進一步研究，但是從試驗結果整體來看，在冷凍稀釋液中添加DCA對凍后精子的畸形率和頂體完整率沒有改善作用。

[1] Polge C.Artificial insemination in pigs[J].Vet Rec，1956，68：62-76.

[2] 禚艷書.豬精液冷凍保存的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2006.

[3] 李剛，李青旺，張樹山，等.豬精液冷凍保存試驗效果初報[J].中國農(nóng)學通報，2005，21（5）：70-75.

[4] 魏世寶，金一，苗婷婷.稀釋液中添加N-乙酰半胱氨酸對豬精液冷凍保存效果的影響[J].黑龍江動物繁殖，2007，15（2）：1-3.

[5] 江一平，卓丹心，陳勇，等.考馬斯亮藍染色法檢測人精子頂體反應的評價[J].解剖學報，1998，29（3）：332-336.