HPLC法測(cè)定貝林司他中有關(guān)物質(zhì)的含量

孫朋杰 張莉 杜超 李偉 卓秋琪

中圖分類(lèi)號(hào) R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）08-0973-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.08.13

摘 要 目的：建立貝林司他中有關(guān)物質(zhì)的含量測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜法檢測(cè)并以加校正因子的主成分自身對(duì)照法進(jìn)行計(jì)算。以O(shè)DS-AM為色譜柱，以1.02%磷酸二氫鉀緩沖液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5）-乙腈（85 ∶ 15，V/V）為流動(dòng)相A、1.02%磷酸二氫鉀緩沖液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5）-乙腈（30 ∶ 70，V/V）為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：貝林司他及雜質(zhì)A、D、F、G、H的線性范圍分別為0.113～1.693、0.050～1.496、0.117～1.750、0.098～1.471、0.120～1.799、0.100～1.506 μg/mL（r≥0.999 7），后5個(gè)雜質(zhì)的校正因子分別為1.0、1.0、1.2、1.5、1.0;檢測(cè)限分別為0.250、0.590、0.490、0.600、0.500 ng，定量限分別為0.500、1.170、0.980、1.200、1.000 ng，回收率為90.18%～111.48%（RSD為1.52%～4.78%，n=9），穩(wěn)定性（100 h）、精密度試驗(yàn)的RSD均不大于16%，耐用性良好。3批貝林司他原料藥中檢測(cè)出雜質(zhì)A、D、H，含量分別為0.030%～0.038%、0.019%～0.022%、0.012%～0.013%，其他最大單體雜質(zhì)含量為0.012%～0.013%，總雜質(zhì)含量為0.075%～0.084%，未檢出雜質(zhì)B、C、F、G。結(jié)論：成功建立了測(cè)定貝林司他中有關(guān)物質(zhì)含量的方法，且方法準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性好。

關(guān)鍵詞 貝林司他;有關(guān)物質(zhì);高效液相色譜法;加校正因子的主成分自對(duì)照法

Content Determination of Related Substances in Belinostat by HPLC

SUN Pengjie1，ZHANG Li1，DU Chao1，2，LI Wei2，ZHUO Qiuqi1（1. Shenzhen Wanle Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shenzhen 518000， China; 2. School of Chemistry and Biological Engineer， Yichun University， Jiangxi Yichun 336000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for the content determination of related substances in belinstat. METHODS： HPLC method was adopted and the principal component self-control comparison method with correction factor was used to calculate the contents of related substances. The determination was performed on ODS-AM column with 1.02% potassium dihydrogen phosphate buffer （pH value adjusted to 3.5 with phosphoric acid）-acetonitrile （85 ∶ 15，V/V） as mobile phase A， 1.02% potassium dihydrogen phosphate? buffer （pH value adjusted to 3.5 with phosphoric acid）-acetonitrile （30 ∶ 70， V/V） as mobile phase B （gradient elution）， at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃， and the detection wavelength was 220 nm. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges of belinstat and impurities A， D， F， G， H were 0.113-1.693， 0.050-1.496， 0.117-1.750， 0.098-1.471， 0.120-1.799， 0.100-1.506 μg/mL （r≥0.999 7）. The correction factors of the last 5 impurities were 1.0， 1.0， 1.2， 1.5， 1.0; the detection limits were 0.250， 0.590， 0.490， 0.600， 0.500 ng， respectively. The quantification limits were 0.500， 1.170， 0.980， 1.200， 1.000 ng， respectively. The recoveries were 90.18%-111.48% （RSD=1.52%-4.78%， n=9）. RSDs of stability （100 h） and precision tests were no more than 16%， and the durability was good. Impurities A， D and H were detected in 3 batches of belinlestat， the contents were 0.030%-0.038%， 0.019%-0.022% and 0.012%-0.013%， respectively. The contents of other maximum monomer impurities were 0.012%-0.013% and the total impurities were 0.075%-0.084%. Impurities B， C，F(xiàn)， G were not detected. CONCLUSIONS： The method for the content determination of related substances in belinstat has been successfully established， and the method is accurate and specific.

KEYWORDS? ?Belinostat; Related substances; HPLC; Principal component self-control? comparison method with correction factor

貝林司他（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）是一種組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑，由美國(guó)Spectrum Technologies公司和丹麥TopoTarget公司聯(lián)合研發(fā)生產(chǎn)，主要用于治療復(fù)發(fā)性或難治性外周T細(xì)胞淋巴瘤（PTCL）[1-5]。貝林司他于2009年被授予孤兒藥地位，用于治療PTCL;2013年，貝林司他的PTCL二期臨床結(jié)果超過(guò)預(yù)期值，其新藥申請(qǐng)于2014年2月6日被美國(guó)FDA受理，并于2014年7月3日通過(guò)審批獲準(zhǔn)上市。目前，在國(guó)內(nèi)已有盛世泰科生物醫(yī)藥技術(shù)（蘇州）有限公司和石藥控股集團(tuán)有限公司對(duì)其進(jìn)行仿制藥臨床申報(bào)[6]。

臨床前體外藥效學(xué)研究顯示，貝林司他對(duì)各種HDAC的抑制作用較好，其不僅能夠提高組蛋白的乙酰化水平，還能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡;更重要的是，貝林司他可優(yōu)先殺傷腫瘤細(xì)胞而非正常細(xì)胞，并可抑制納摩爾濃度HDAC的活性[7-11]。毒性研究顯示，貝林司他有一定的毒性，但是相對(duì)于該藥給復(fù)發(fā)性、難治性淋巴瘤患者帶來(lái)的臨床獲益，這些毒性反應(yīng)是可以接受的[12-14]。此外，貝林司他用于治療卵巢癌、胸腺上皮癌、骨髓異常增生癥、惡性腹膜間皮瘤等其他腫瘤的二期臨床試驗(yàn)研究結(jié)果均顯示，其具有較好的療效[14-17]。由此可見(jiàn)，貝林司他的臨床使用前景良好。

有關(guān)物質(zhì)主要是在生產(chǎn)過(guò)程中帶入的起始原料、中間體、聚合體、副反應(yīng)產(chǎn)物，以及貯藏過(guò)程中的降解產(chǎn)物等，其中生產(chǎn)過(guò)程中帶入的列為工藝雜質(zhì)，貯藏過(guò)程中新增或含量出現(xiàn)增長(zhǎng)的雜質(zhì)列為降解雜質(zhì)。有關(guān)物質(zhì)是藥品質(zhì)量研究的關(guān)鍵項(xiàng)目之一，其含量高低是反映藥品純度的直接指標(biāo)。有研究指出，對(duì)藥品的純度要求，應(yīng)基于安全性和生產(chǎn)實(shí)際情況兩方面的考慮[18]。基于此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）聯(lián)合加校正因子的主成分自身對(duì)照法針對(duì)貝林司他生產(chǎn)及貯藏中可能引入的7種雜質(zhì)進(jìn)行定性分析，考慮到雜質(zhì)對(duì)照品的可獲得性僅對(duì)其中5種雜質(zhì)進(jìn)行定量分析，以期能將各雜質(zhì)及主成分有效分離，并為貝林司他的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括e2695型HPLC儀（美國(guó)Waters公司）、XP205型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

貝林司他原料藥（批號(hào)171201、180101、180102，純度≥99%）、雜質(zhì)A對(duì)照品（批號(hào)140813，純度99.3%）、雜質(zhì)B對(duì)照品（批號(hào)140810，純度99.5%）、雜質(zhì)C對(duì)照品（批號(hào)140822，純度99.4%）、雜質(zhì)D對(duì)照品（批號(hào)140801，純度99.9%）、雜質(zhì)F對(duì)照品（批號(hào)140806，純度99.1%）、雜質(zhì)G對(duì)照品（批號(hào)150416，純度99.5%）、雜質(zhì)H對(duì)照品（批號(hào)140903，純度98.6%）均由深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司提供;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以O(shè)DS-AM（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以1.02%磷酸二氫鉀緩沖液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5）-乙腈（85 ∶ 15，V/V）為流動(dòng)相A、1.02%磷酸二氫鉀緩沖液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5）-乙腈（30 ∶ 70，V/V）為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取貝林司他原料藥約50 mg，置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相B溶解并定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的供試品溶液。

2.2.2 自身對(duì)照溶液 取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液1 mL，置于1 000 mL量瓶，加流動(dòng)相B稀釋并定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL的自身對(duì)照溶液。

2.2.3 雜質(zhì)單一對(duì)照品溶液 取雜質(zhì)A、B、C、D、F、G、H對(duì)照品適量，均用流動(dòng)相B溶解、稀釋?zhuān)瑩u勻，制成質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性混合溶液 取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液和“2.2.3”項(xiàng)下雜質(zhì)A、B、C、D、F、G、H的單一對(duì)照品溶液各適量，用流動(dòng)相B溶解、稀釋?zhuān)瑩u勻，制成貝利司他質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，雜質(zhì)A、B、C、D、F、G、H質(zhì)量濃度均為5 μg/mL的系統(tǒng)適用性混合溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取系統(tǒng)適用性混合溶液和空白溶液（流動(dòng)相B）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，雜質(zhì)F、雜質(zhì)B、貝林司他、雜質(zhì)H、雜質(zhì)D、雜質(zhì)G、雜質(zhì)C、雜質(zhì)A的出峰時(shí)間依次為16.123、18.475、19.222、21.699、29.609、35.165、38.227、42.317 min;以貝林司他峰計(jì)，各峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.84、0.96、1.00、1.13、1.54、1.83、1.99、2.20;分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于80 000;空白溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1。

2.4 破壞試驗(yàn)

取貝林司他原料藥適量，分別進(jìn)行高溫（100 ℃下放置48 h）、光照[（5 000±500）lx下放置45天]、酸（加2 mol/L鹽酸溶液2 mL，于60 ℃下加熱1.5 h）、堿（加2 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，于60 ℃下加熱1.5 h）、氧化（加5%H2O2溶液2 mL，于60 ℃下加熱6 h）破壞試驗(yàn)，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并與未破壞的供試品溶液進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，在不同的破壞條件下，貝林司他與各降解物均能有效分離，其中貝林司他對(duì)溫度、光照均較穩(wěn)定，對(duì)酸、堿、氧均較敏感，且其主要降解雜質(zhì)均為雜質(zhì)D，詳見(jiàn)圖2（以主成分為參照，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間判定各色譜峰的歸屬）。

2.5 線性關(guān)系和校正因子考察

精密稱(chēng)取貝林司他原料藥和雜質(zhì)A、D、F、G、H對(duì)照品各約10 mg，置于100 mL量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻;移取上述溶液5 mL，置于100 mL量瓶，加流動(dòng)相B稀釋至刻度，得混合線性對(duì)照品貯備液。取貯備液適量，用流動(dòng)相B稀釋至各雜質(zhì)含量分別為主成分的0.02%、0.04%、0.08%、0.10%、0.12%、0.24%、0.30%，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，以主成分為參比物質(zhì)計(jì)算校正因子（即主成分貝林司他的線性斜率/對(duì)應(yīng)雜質(zhì)的線性斜率）。貝林司他和5個(gè)雜質(zhì)的線性關(guān)系及校正因子見(jiàn)表2。

2.6 檢測(cè)限與定量限考察

取“2.5”項(xiàng)下混合線性對(duì)照品貯備液以流動(dòng)相B進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比3 ∶ 1、10 ∶ 1分別計(jì)算檢測(cè)限和定量限。結(jié)果，雜質(zhì)A、D、F、G、H的檢測(cè)限分別為0.250、0.590、0.490、0.600、0.500 ng，定量限分別為0.500、1.170、0.980、1.200、1.000 ng。

2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取貝林司他原料藥適量，精密稱(chēng)定，加入“2.5”項(xiàng)下混合線性對(duì)照品貯備液，制成對(duì)應(yīng)單個(gè)雜質(zhì)濃度為0.05%、0.10%、0.20%的樣品溶液，各配制3份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率。結(jié)果，雜質(zhì)A、D、F、G、H的回收率分別為99.21%～106.78%、95.01%～111.48%、100.19%～104.45%、90.18%～100.56%、95.03%～104.33%，RSD分別為2.37%、4.78%、1.52%、3.65%、3.86%（n=9），表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別在室溫（放置0、12、52、100 h）、冰箱冷藏（2～8 ℃，放置0、50、100 h）下保存，分別于上述時(shí)間點(diǎn)精密量取10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算含量。結(jié)果，主成分和總雜質(zhì)含量基本穩(wěn)定，無(wú)新雜質(zhì)出現(xiàn);檢出雜質(zhì)A、D、H，未檢出雜質(zhì)B、C、F、G，提示供試品溶液在上述條件下放置100 h穩(wěn)定，詳見(jiàn)表3、表4。

2.9 精密度試驗(yàn)

2.9.1 重復(fù)性 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并按加樣正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算含量。結(jié)果，供試品溶液中只檢測(cè)出雜質(zhì)A、D、H，未檢出雜質(zhì)B、C、F、G，詳見(jiàn)表5。

2.9.2 中間精密度 分別由2名試驗(yàn)人員于不同時(shí)間按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算含量。結(jié)果，供試品溶液中只檢測(cè)出雜質(zhì)A、D、H，未檢出雜質(zhì)B、C、F、G，詳見(jiàn)表6。

2.10 耐用性試驗(yàn)

按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液和自身對(duì)照溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件基礎(chǔ)上，調(diào)整流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、柱溫（25、30、35 ℃）、色譜柱[ODS-AM（250 mm×4.6 mm，5 μm），批號(hào)054、055、056]，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按加樣正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算含量。結(jié)果，在不同色譜條件下，雜質(zhì)A、D、H含量變化值最大分別為0.002%、0.004%、0.002%，最大單雜含量變化值最大為0.002%，總雜質(zhì)含量變化值最大為0.008%，雜質(zhì)B、C、F、G均未檢出，詳見(jiàn)表7。

2.11 貝林司他原料藥中有關(guān)物質(zhì)含量的測(cè)定

取3批貝林司他原料藥，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算含量。結(jié)果，貝林司他樣品中只檢測(cè)出了雜質(zhì)A、D、H，且含量均符合規(guī)定（本研究根據(jù)ICH指導(dǎo)原則[19]及本品實(shí)際生產(chǎn)情況，擬定最大單雜不得過(guò)0.1%），雜質(zhì)B、C、F、G均未檢出，詳見(jiàn)表8。

3 討論

3.1 色譜條件的篩選

經(jīng)筆者查詢，國(guó)內(nèi)外藥典均無(wú)貝林司他有關(guān)物質(zhì)檢查方法和含量測(cè)定方法的相關(guān)規(guī)定。本研究首先經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索擬定初步的色譜條件，之后根據(jù)所需要研究的雜質(zhì)情況對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果，所建方法不受空白溶劑的干擾，主峰與前后相鄰雜質(zhì)分離度均大于1.5。

3.2 稀釋劑的選擇

貝林司他原料藥及雜質(zhì)對(duì)照品在水中的溶解度均較差，在有機(jī)溶劑中的溶解度較好。為了減少樣品稀釋劑與流動(dòng)相差異引起的基線波動(dòng)，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相B[1.02%磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.5）-乙腈（30 ∶ 70，V/V）]對(duì)貝林司他和雜質(zhì)的溶解性均較好，且對(duì)其測(cè)定無(wú)干擾，因此選擇流動(dòng)相B作為溶劑。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，貝林司他及各雜質(zhì)在220 nm波長(zhǎng)附近均有較大吸收，因此選擇220 nm作為貝林司他有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上所述，本研究所建立的HPLC法能使貝林司他的主峰與雜質(zhì)A、B、C、D、F、G、H得到良好分離。同時(shí)，破壞試驗(yàn)結(jié)果顯示，貝林司他降解過(guò)程中質(zhì)量基本穩(wěn)定，且主峰與各降解雜質(zhì)均能達(dá)到良好分離。經(jīng)檢驗(yàn)，本研究中所使用的3批貝林司他原料藥中僅存在雜質(zhì)A、D、H，且含量均較低，雜質(zhì)B、C、F、G均未檢出。可見(jiàn)，本研究成功建立了測(cè)定貝林司他中有關(guān)物質(zhì)含量的方法，且方法準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性好。

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（收稿日期：2020-12-29 修回日期：2021-03-30））

（編輯：鄒麗娟）