2017-2020年江門地區兒童手足口病流行病學特征及非EV71型非CA16型腸道病毒型別分析

阮燕如 陸少顏

【摘要】 目的：分析廣東省江門市2017-2020年手足口病的流行特征，了解非EV71型非CA16型腸道病毒的分子流行病學特征，為本市進一步臨床治療和防控工作提供科學依據。方法：通過全國傳染病報告信息管理系統收集2017-2020年本市手足口病患兒資料，收集整理2017-2020年本院信息系統報告的手足口病例及分析其流行特征，采用熒光RT-PCR法對疑似手足口病患者標本同時進行EV通用型、EV71型、CA16型檢測，并選取EV71型和CA16陰性而EV通用型陽性的標本進行型別鑒定，設計5非編碼區特異性引物，RT-PCR擴增后進行序列測定，最后對核苷酸的同源性進行比對及確定病毒的型別。結果：2017-2020年江門市共報告HFMD總發病人數為31 709例，其中2017年報告病例數最高。4年內共采集了因懷疑手足口病到本院就診患兒的2 587例標本，并同時進行EV通用型、EV71型、CA16型檢測，總陽性1 263例，總陽性率為48.82%。陽性主要以托幼兒童和男患兒為主。其中EV71核酸陽性173例，占13.70%;CA16核酸陽性282例，占22.33%;其他EV核酸陽性808例，占63.97%。在2017-2020年中確定屬于腸道病毒分型共87份，檢出的非EV71型非CA16型的腸道病毒有6種型別，分別為CA6、CA10、CA4、CA12、CA5、CA8，其中CA6是占主要的，為70.11%，其次是CA10占13.79%。結論：江門市手足口病的分布呈現出人群差異、季節差異，非EV71型非CA16型的腸道病毒病原譜有六種，病毒型別以CA6為主。應持續進行病原學檢測，掌握優勢型別，為防控提供依據。

【關鍵詞】 手足口病 流行病學 病原學監測 非EV71非CA16腸道病毒 病原譜

Epidemiological Characteristics of Hand Foot Mouth Disease and Analysis of Non EV71 and Non CA16 Enterovirus Types in Children in Jiangmen/RUAN Yanru， LU Shaoyan. //Medical Innovation of China， 2021， 18（12）： 0-101

[Abstract] Objective： To analyze the epidemiological characteristics of hand foot mouth disease （HFMD） in Jiangmen City， Guangdong Province from 2017 to 2020， and to understand the molecular epidemiological characteristics of non EV71 and non CA16 enterovirus， so as to provide scientific basis for further clinical treatment and prevention and control. Method： Through the national infectious disease reporting information management system to collect the information of HFMD cases in our city from 2017 to 2020， the HFMD cases reported in our hospital from 2017 to 2020 were collected and sorted out and their epidemic characteristics were analyzed. The samples of suspected HFMD patients were detected by fluorescent RT-PCR， and EV71 and CA16 were selected as negative， while EV universal was positive， 5 non coding region specific primers were designed. RT-PCR was used to amplify the 5 non coding region specific primers， and then the sequences were determined. Finally， the nucleotide homology was compared and the virus type was determined. Result： A total of 31 709 HFMD cases were reported in Jiangmen City from 2017 to 2020， among which the highest number was reported in 2017. A total of 2 587 samples of suspected HFMD patients in our hospital were collected in 4 years， and EV universal， EV71， CA16 were detected at the same time， the total positive rate was 48.82% （1 263 cases）. The positive rate was mainly in children and men. Among them， 173 cases were EV71 nucleic acid positive， accounting for 13.70%; 282 cases were CA16 nucleic acid positive， accounting for 22.33%; 808 cases were other EV nucleic acid positive， accounting for 63.97%. A total of 87 enterovirus genotypes were identified in 2017-2020， six types （CA6， CA10， CA4， CA12， CA5， CA8） of enterovirus were detected， including non EV71 and non CA16， among which CA6 was the main， accounting for 70.11%， followed by CA10， accounting for 13.79%. Conclusion： The distribution of HFMD in Jiangmen City shows population and seasonal differences， there are six kinds of enterovirus spectrum of non EV71 and non CA16， and CA6 is the main virus type. The pathogen detection should be carried out continuously to master the dominant types and provide the basis for prevention and control.

[Key words] HFMD Epidemiology Etiology monitoring Non EV71 and non CA16 enterovirus Pathogen spectrum

First-authors address： Jiangmen Maternity and Child Health Care Hospital， Jiangmen 529000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.12.023

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是由腸道病毒（EV）感染引起的兒童常見傳染病，多發生于5歲以下兒童，臨床癥狀主要為發熱和手、足、口腔等部位出現水皰，個別患兒可發生心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜炎等致命性疾病[1-2]。2008年，我國將手足口病定為丙類傳染病。自1957年報道HFMD疫情以來，腸道病毒71型（enterovirus71，EV71）和柯薩奇病毒A組16型（coxsackievirus16，CA16）是兩種主要的HFMD病原體，但近年來全國手足口病病原譜發生了改變，因而非EV71型非CA16型腸道病毒引起的HFMD同樣不容忽視[3]。近年來，有關非EV71型非CA16型腸道病毒引起手足口病的報道在國內乃至全球成逐年上升的趨勢。近年來我國局部地區有小暴發，特別是在2008年我國全國首次出現大規模的手足口病暴發，2008年至今感染手足口病例多達幾百萬人次。因此，為了更進一步了解手足口病流行特征和病原變化趨勢，掌握近年來手足口病的流行特征，評價和改進現行的防治措施，本研究將對2017-2020年江門地區HFMD病原檢測結果進行總結分析以及分子流行病學分析，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2017-2020年江門市手足口病患兒資料，資料來源于全國傳染病報告信息管理系統的手足口病疫情數據。收集2017年1月-2020年12月因懷疑手足口病到本院就診患兒的2 587份標本，標本大部分為肛拭子（約占90%），其中少量為咽拭子、腦脊液、大便和皰疹液，年齡10 d～6歲，其中男1 568例，女1 019例。嚴格按照《手足口病預防控制指南（2014年版）》要求采集標本、運輸、保存和處理標本。病原學標本均經過醫院倫理委員會審查和患者家屬簽署知情同意書后采集。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取 使用西安天隆NP968型全自動核酸提取儀及配套的腸道病毒RNA試劑提取RNA。

1.2.2 病原學熒光RT-PCR方法檢測 2 587份標本均同時進行腸道病毒通用型、CA16型、EV71型檢測，試劑使用上海之江生物科技有限公司生產的手足口病腸道病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒，對CA16型、EV71型陰性而腸道病毒通用型陽性的標本作為本次研究的對象。使用美國ABI7500型實時熒光定量PCR儀進行檢測，結果按照說明書進行判斷。

1.2.3 非EV71型、非CA16型腸道病毒的PCR檢測 對腸道病毒基因組的5，端非編碼區設計特異性引物[4]。使用RNA快速純化試劑盒提取病毒RNA作為模板，進行反轉錄再進行普通PCR擴增，擴增結束后進行電泳，把電泳片段符合大小的PCR產物送深圳華大基因進行測序，最后對核苷酸的同源性進行比對及確定病毒的型別。

1.3 統計學處理 采用流行病學方法分析手足口病流行特征，數據分析采用Excel 2010軟件。

2 結果

2.1 流行病學特征

2.1.1 時間分布 2017-2020年江門市共報告HFMD總發病人數為31 709例，其中，2017年報告病例數最高12 476例。手足口病發病每個月均有病例報告，從總體曲線分析，2017-2018年每年2-3月發病人數最低，隨后逐漸上升，到6月達到高峰，隨后慢慢下降，8月降至最低，隨后又有上升趨勢，到冬季又出現高峰。2019年6月達到高峰后，病例逐漸減少，冬季也沒有再出現高峰，而2020年本市HFMD病例一直維持低發病水平，流行曲線表現為非流行狀態，發病強度始終保持在基線以下，原因與新冠肺炎疫情影響有關。2017-2020年江門市HFMD發病的時間分布，見圖1。

2.1.2 人群分布 收集2017年1月-2020年12月因懷疑HFMD到本院就診患兒的2 587份標本。2 587份標本均同時進行腸道病毒通用型、CA16型、EV71型檢測，總陽性1 263份。1 263例手足口病患兒以托幼兒童為主，905例（905/

1 263，71.65%）;散居兒童，315例（315/1 263，24.94%）;學生43例（43/1 263，3.41%），見圖2。年齡分布，出現HFMD年齡最小2個月，最大6歲，其中發病集中在0～5歲兒童，1～3歲是高發年齡，占比由高到低為2～3歲（543/1 263，42.99%），1～2歲（347/1 263，27.47%），3歲以上（212/1 263，16.78%），0～1歲（161/1 263，12.75%）。性別分布，各年齡段HFMD男患兒均多于女患兒，在總腸道病毒陽性的1 263例患者中，男患兒806例，女患兒457例，男女性別比例為1.76︰1。

2.2 病原學檢測 2017-2020年同時進行3類病毒檢測的手足口病標本2 587份，總陽性1 263份，總陽性率為48.82%，全陰性標本為1 324份，占51.18%。其中EV71核酸陽性173份，占13.70%;CA16核酸陽性282份，占22.33%;其他EV核酸陽性808份，占63.97%。不同年份的優勢病原具有不同的流行趨勢，CA16和EV71等腸道病毒同時存在，交替流行。2017-2020年其他EV占當年檢出病毒的構成比依次為59.69%、55.86%、73.55%、76.67%，見表1。均無重癥病例和死亡病例。

2.3 非EV71非CA16腸道病毒擴增及分析 2017-2020年同時進行3類病毒檢測的手足口病標本

2 587份，總陽性1 263份，其中其他EV核酸陽性808例，實驗室對這些標本進行隨機抽取實驗，2017-2020年每年各隨機選取了45份標本提取RNA并進行反轉錄，然后進行普通PCR，2017年成功擴增32份，2018年成功擴增28份，2019年成功擴增33份，2020年成功擴增23份，電泳片段符合預期大小的PCR產物送深圳華大基因測序，序列進行比對后，確定屬于腸道病毒分型共87份標本，其中CA6在非EV71型非CA16型腸道病毒中占主要病原，檢出率為70.11%，第二位是CA10病毒，檢出率為13.79%。各型別病原譜，見表2。

3 討論

手足口病是一種在全世界范圍內廣泛流行的嬰幼兒高發性腸道傳染病，因其嚴重威脅嬰幼兒的健康而越來越被各國政府和衛生部門所重視。我國不同地區也已經出現了不同程度的流行，因此手足口病已成為我國日益關注的公共衛生問題[5]。以前，國內手足口病病原學研究大多集中在EV71型和CA16型[6]，近年來，非EV71型和非CA16型其他非傳統型別的優勢病原引起的手足口病逐漸受到關注，其中，CA6、CA10等已在我國引起過較大規模的疫情。Guan等[7]對2009-2013年的山東濟南地區的非EV71和非CA16型別的腸道病毒流行情況研究時發現手足口病感染的主要病原是CA6和CA10，而不是EV71和CA16。因此，對非EV71型和非CA16型別的腸道病毒進行研究已逐漸達成共識。在此背景下，本研究對2017-2020年引起手足口病進行流行病學調查和了解手足口病的病原學構成研究，對其傳播危險因素疫情預警等進行分析，以便采取有效的預防控制措施，降低手足口病的發生率，更好地為臨床提供依據。

本次研究結果表明，2017-2020年本市手足口病曲線呈季節性，在每年的5-7月形成高峰，在9-11月又出現一個小高峰，這與文獻[8-10]報道相一致。因腸道病毒適合濕熱條件下生長，而每年的5-7月氣溫上升，環境濕度較大，病毒易于生存且容易傳播，所以發病的季節性與病毒的流行特征相符合，呈正相關關系[11]。2020年疑似病例報告數和腸道病毒檢出率大幅下降，排除疫苗接種的影響，更重要的原因是受到新冠肺炎疫情的影響，大家的防控意識增強。

發病人群分布結果顯示，男患兒發病率遠高于女患兒，手足口病發病率在性別上的差異目前暫無科學的研究，大多數認為可能與男性好動，更容易接觸病毒有關[12]。發病年齡以5歲以下兒童多見，與其自身免疫系統尚未完善、此年齡段的兒童活潑好動、個人衛生習慣不到位有關。而1歲以內嬰幼兒活動范圍受限，加上從母體獲得免疫力，因此1歲以內的嬰幼兒的發病率相對較低。托幼兒童是本市手足口病發病最多的群體，占發病總數的71.65%，其次是散居兒童，占發病總數的24.94%，兩者占所有發病人數的96.59%。由于腸道病毒通過糞-口途徑傳播和接觸傳播，由于托幼兒童容易聚集，交叉接觸，因而針對托幼機構，相關部門要加強監督管理，加強老師和管理者的防控觀念，及時采取有效的預防措施，同時教育兒童養成良好的衛生習慣，避免發生暴發流行。

2017-2020年共收集和檢測了因懷疑手足口病到本院就診患兒的2 587例標本，并同時進行EV通用型、EV71型、CA16型檢測，分析EV71型、CA16型、非EV71型和非CA16型腸道病毒在手足口患者中的流行情況。EV71病毒在這四年中的標本陽性平均檢出率為10.21%，EV71所占病原構成比總體上呈現下降的趨勢，這可能與EV71疫苗在全國大范圍推廣有關，而CA16在四年中的檢出率相對平穩。非EV71型和非CA16型腸道病毒在2017-2020年手足口病病原中占比一直都很高，已成為手足口病感染的主要病原體，其中2017-2020年的非EV71型和非CA16型腸道病毒的檢出率分布為59.69%、55.86%、73.55%、76.67%，從本統計結果發現，雖然這四年的手足口病沒有前幾年大規模流行，但引起手足口病的病原體已經有了較大的變化，非EV71型和非CA16型的其他腸道病毒已經成為主要病原，這與國內一些研究相同[13-15]。

為了進一步分析非EV71型和非CA16型腸道病毒具體型別，2017-2020年每年隨機抽取了腸道病毒通用型陽性而EV71型和CA16型陰性的標本各45例，再提取RNA及測序分析。確定屬于腸道病毒分型共87份標本，共確定了6種型別，其中CA6在非EV71型非CA16型腸道病毒中占主要病原，檢出率為70.11%，第二位是CA10病毒，檢出率為13.79%，這與國內外許多學者的研究相一致，如張穎等[16]對廣州地區在2010-2015年手足口病原檢測和流行分析研究時發現CA6的比例是非EV71型和非CA16型的腸道病毒最高，其次是CA10。而國內部分地區結果顯示CA10是非EV71型和CA16型腸道是病毒的首位，如王海濱等[17]對北京市朝陽區手足口非EV71型非CA16型腸道病毒的基因型分析CA10為EV-U的首位;孫國清等[18]對河南省安陽市手足口病相關柯薩奇病毒研究發現近年來CA10的流行水平較CA6高并存在總體上升的風險。

目前，隨著EV71疫苗的廣泛應用，對手足口病的流行特征和病原譜帶來了顯著的變化，如何根據這些變化而做出相應的防控措施，還待進一步研究。自2008年手足口病暴發以來，EV71和CA16成為主要病原體[19-20]。但近年來，非EV71型非CA16型腸道病毒比例逐漸上升，或將取代EV71、CA16成為主要病原體，因而如何確定型別，加強對手足口病原譜的日常監測，掌握其分子流行病學特征，為手足口病的防控和臨床治療提供可靠的依據。

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（收稿日期：2021-02-02） （本文編輯：程旭然）