基于轉錄組學的敦煌顫震方保護PD陰虛動風證大鼠DA能神經元的機制研究

孫 雪 梁建慶,2* 何建成 馬利芳

1.甘肅中醫藥大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000；2.敦煌醫學與轉化教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.上海中醫藥大學基礎醫學院，上海 201203

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是全球第二大神經退行性疾病，全世界現有約580萬PD患者，中國患病人數約為260萬，居世界第一位[1]。PD的主要病理特征是中腦黑質致密部多巴胺(dopamine，DA)能神經元變性缺失，導致紋狀體內DA含量減少到80%以上，患者出現臨床癥狀[2]。明確DA能神經元損傷的機制，對PD的防治具有重要意義。筆者利用Illumina HiSeq高通量測序平臺技術，獲得正常組、模型組、敦煌顫震方組大鼠右側黑質及紋狀體的轉錄組信息，對篩選得到的差異表達基因進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，旨在為深入探究DA能神經元的存活方式以及對敦煌顫震方的藥理作用等分子應答機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及條件 健康雄性SPF級SD大鼠，體質量180～200g，鼠齡38～40周，18只，由甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號碼：SCXK(甘)2015-0002。飼養期間保持自由飲水和進食，飼養環境溫度為(24±1)℃，濕度為(55±5)%，實驗前適應性喂養1周。

1.2 主要試劑和儀器 6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA, 批號：MKBP0832V)、阿撲嗎啡(apomorphine，APO，批號：SLBF6369V)、抗壞血酸(批號：063K1082)：美國Sigma公司產品。戊巴比妥鈉(批號：WS20130212)：上海中西藥業股份有限公司產品；慶大霉素(批號: 20230675)：上海第一制藥廠產品，0.3 g/支。

大鼠腦立體定位儀：RWD-68003型，深圳瑞沃德生命科技有限公司；高速冷凍離心機：Multifuge IS-R，德國THERMO公司；超聲破碎儀：XL 2000，美國MISONIX公司；微量進樣器：5 μL，上海第三分析儀器廠；漩渦混勻器：XW-80A，上海醫科大學儀器廠；分析天平：910324，Sartorius anglytic；秒表：926266，上海秒表廠。

1.3 藥物制備 敦煌顫震方組成：山茱萸20 g，牛膝20 g，黃芪20 g，桂枝12 g，桃仁12 g，枳殼10 g，茯苓10 g，檳榔10 g，白蒺藜10 g。按既定工藝煎煮成湯藥，由甘肅中醫藥大學中藥制藥實驗室提供。敦煌顫震方組的給藥劑量按人體每日用量換算成大鼠灌胃劑量，溶解于0.9%氯化鈉溶液，配制成相應灌胃濃度[3]。

1.4 模型制備、分組及給藥 采用Ungerstedt等[4]建立并經過本課題組驗證的二點法進行模型構建[5-8]。術前按常規進行行為測試，確認無異常旋轉行為后，用3%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉。然后將大鼠固定于腦立體定位儀上，頭部去毛，苯扎溴銨(商品名:新潔爾滅)常規消毒。無菌條件下，沿正中線切開大鼠顱頂皮膚，剝離骨膜，暴露前囟。以前囟為準，根據包新民等[6]著大鼠腦立體定位圖譜，確定右側黑質二坐標:①前囟后5.2 mm，正中線右側1.0 mm，硬膜下9.0 mm。②前囟后5.2 mm，正中線右側2.5 mm，硬膜下8.5 mm。用顱骨鉆于手術要求部位小心鉆開顱骨，用5 μL微量進樣器將6-OHDA(溶于含0.2%維生素C的生理鹽水中，即秤量藥品抗壞血酸0.001 g，溶于生理鹽水0.5 mL中)注入右側黑質部(以1.0 mm/min速度緩慢進針)，每孔3 μL，注射速度為1 μL/min，注射完畢后留針5 min，然后以1.0 mm/min速度緩慢退針。手術完成后，用醫用明膠海綿填塞顱骨孔，縫合切口皮膚，肌肉注射慶大霉素7 d，待動物清醒后放回飼養籠中飼養。10 d后，以腹腔注射APO 0.5 mg/kg誘發大鼠向一側旋轉，記錄開始旋轉至30 min內的旋轉圈數，以旋轉圈數平均7次/min者為合格的PD模型。

模型制備成功后，采用分層隨機法將12只PD陰虛動風證模型大鼠分為2組：模型組，敦煌顫震方組(14 g/kg)，每組6只；另取6只大鼠不作造模處理設為正常組。敦煌顫震方組用0.9%氯化鈉溶液溶解，每天灌胃1次；正常組和模型組以等體積0.9%氯化鈉溶液(2 mL/只)灌胃，連續用藥6周。處死大鼠，取右側黑質及紋狀體組織，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存。本實驗中動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.5 實驗指標測定

1.5.1 樣品檢測 Nanodrop檢測右側黑質及紋狀體組織中RNA的純度(OD260/280)、濃度、核酸吸收峰；Agilent 2100檢測RNA的完整性，檢測指標包括：RIN值、28S/18S、圖譜基線有無上抬、5S峰。

1.5.2 文庫構建 樣品檢測合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA，加入Fragmentation Buffer將mRNA進行隨機打斷，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物(random hexamers)合成第一條cDNA(complementary DNA)鏈，然后加入緩沖液、dNTPs(Dideoxynucleotide)、RNase H(Ribonuclease H)和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA，純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進行片段大小選擇，最后通過PCR(Polymerase Chain Reaction)富集得到cDNA文庫。

1.5.3 文庫質控 使用Qubit 2.0進行初步定量，使用Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測，insert size符合預期后才可進行下一步實驗。Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度>2 nM)，完成庫檢。

1.5.4 上機測序 庫檢合格后，不同文庫按照目標下機數據量進行pooling，用IlluminaHi Seq平臺進行測序。委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.6 生物信息學分析 將下機數據進行過濾得到Clean Data，與指定的參考基因組進行序列比對；根據基因在不同樣品組中的表達量進行差異表達分析、差異表達基因KEGG注釋及通路富集分析。

2 結果

2.1 各組比對結果作圖 將各組大鼠比對到不同染色體上的Reads進行位置分布統計，繪制Mapped Reads在所選參考基因組上的覆蓋深度分布圖，便于后續分析。如圖1所示。

圖1 Mapped Reads在參考基因組上的位置及覆蓋深度分布注：A.正常組(右側黑質)；B.正常組(右側紋狀體)；C.模型組(右側黑質)；D.模型組(右側紋狀體)；E.敦煌顫震方組(右側黑質)；F.敦煌顫震方組(右側紋狀體)。橫坐標為染色體位置；縱坐標為覆蓋深度以2為底的對數值。藍色為正鏈，綠色為負鏈。

2.2 差異基因表達篩選火山圖 正常組和模型組(右側黑質/右側紋狀體)之間有143/149個顯著性差異表達基因，其中78/86個基因上調表達，65/63個基因下調表達；正常組和敦煌顫震方組(右側黑質/右側紋狀體)之間有83/91個顯著性差異表達基因，其中47/50個基因上調表達，36/41個基因下調表達；模型組和敦煌顫震方組(右側黑質/右側紋狀體)之間有56/61個顯著性差異表達基因，其中31/31個基因上調表達，25/30個基因下調表達。如圖2所示。

圖2 3組組間差異基因表達篩選火山圖注：A.正常組VS模型組(右側黑質)；B.正常組VS模型組(右側紋狀體)； C.正常組VS敦煌顫震方組(右側黑質)；D.正常組VS敦煌顫震方組(右側紋狀體)；E.模型組VS敦煌顫震方組(右側黑質)；F.模型組VS敦煌顫震方組(右側紋狀體)。差異表達火山圖中的每一個點表示一個基因，橫坐標表示某一個基因在兩樣品中表達量差異倍數的對數值；縱坐標表示基因表達量變化的統計學顯著性的負對數值。圖中綠色的點代表下調差異表達基因，紅色的點代表上調差異表達基因，黑色的點代表非差異表達基因。

2.3 差異基因表達篩選MA圖 通過MA圖可以直觀地查看兩組樣品之間差異基因表達水平的整體分布。具體結果見表1、圖3。

圖3 3組組間差異基因表達篩選MA圖注：A.正常組VS模型組(右側黑質)；B.正常組VS模型組(右側紋狀體)； C.正常組VS敦煌顫震方組(右側黑質)；D.正常組VS敦煌顫震方組(右側紋狀體)；E.模型組VS敦煌顫震方組(右側黑質)；F.模型組VS敦煌顫震方組(右側紋狀體)。差異表達基因MA圖中每一個點代表一個基因。橫坐標為A值，縱坐標為M值，用于衡量表達量差異的大小。圖中綠色的點代表下調差異表達基因，紅色的點代表上調差異表達基因，黑色的點代表非差異表達基因。

表1 差異表達基因數目統計表

2.4 差異表達基因KEGG注釋 對差異表達基因KEGG的注釋結果按照KEGG中通路類型進行分類，分類結果如圖4所示。

圖4 3組組間差異表達基因KEGG注釋注：A.正常組VS模型組(右側黑質)；B.正常組VS模型組(右側紋狀體)； C.正常組VS敦煌顫震方組(右側黑質)；D.正常組VS敦煌顫震方組(右側紋狀體)；E.模型組VS敦煌顫震方組(右側黑質)；F.模型組VS敦煌顫震方組(右側紋狀體)。縱坐標為KEGG代謝通路的名稱，橫坐標為注釋到該通路下的基因個數及其個數占被注釋上的基因總數的比例。

2.5 差異表達基因KEGG通路富集分析 通過KEGG富集分析得到：PI3K-Akt Signaling pathway(PI3K-Akt信號通路)、MAPK Signaling pathway(MAPK信號通路)、cAMP signaling pathway(cAMP信號通路) 、TNF signaling pathway(腫瘤壞死因子信號通路)、cGMP-PKG signaling pathway(cGMP-PKG信號通路)等通路, 這些均與PD相關；還發現Valine, leucine and isoleucine degradation(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解)、Protein digestion and absorption(蛋白質消化吸收)、Vitamin B6 metabolism(維生素B6代謝)等途徑的差異顯著,說明這些代謝途徑極有可能與DA能神經元分化相關。

圖5 3組組間差異表達基因KEGG通路富集分析注：A.正常組VS模型組(右側黑質)；B.正常組VS模型組(右側紋狀體)； C.正常組VS敦煌顫震方組(右側黑質)；D.正常組VS敦煌顫震方組(右側紋狀體)；E.模型組VS敦煌顫震方組(右側黑質)；F.模型組VS敦煌顫震方組(右側紋狀體)。圖中每一個圓表示一個KEGG通路，縱坐標表示通路名稱。

3 討論

課題組以中西醫理論為基礎，結合多年的臨床經驗，認為PD病在筋脈，與肝、脾、腎等臟關系密切。基本病機為肝風內動，筋脈失養。《素問·痿論》曰：“肝主身之筋膜。”《素問·六節臟象論》云：“肝者……其充在筋。”《素問·經脈別論》道：“食氣入胃，散精于肝，淫氣于筋。”《素問·上古天真論》認為：“七八，肝氣衰，筋不能動。”肝為風木之臟，其氣血虧虛，筋脈失養，則肝風內動，筋脈不能任持自主，隨風而動，牽動肢體及頭頸顫抖搖動。《素問·陰陽應象大論》岐伯曰：“人年四十而陰氣自半也，起居衰矣。”肝腎乙癸同源，年高體衰，腎精漸虧，或勞欲過度，致肝腎陰虛，腎虛髓減，腦髓不充，風陽上擾，上盛下虛則高搖。肝木橫克脾土，可致痰濕內生。日久可導致絡脈瘀阻，出現肢體僵硬，動作遲滯乏力之象。故本病的病理性質為本虛標實證，本虛為肝腎虧損，臟腑功能失調；標實為風、痰、瘀互結，蘊塞腦竅。內風是本病病理演變過程中始終貫穿的因素之一，是發病的主要原因。故課題組提出“滋補肝腎、活血祛瘀、化痰消積”諸法合用是其治療法則。據此立法組方，充分挖掘敦煌醫學的文獻資料，研制了治療PD的中藥復方—敦煌顫震方[9]。該方由山茱萸、牛膝、黃芪、桂枝、桃仁、枳殼、茯苓、檳榔、白蒺藜組成，方中山茱萸性微溫味酸，歸肝、腎經，可補益肝腎、補精助陽。《日華子本草》認為山茱萸善“暖腰膝，助水臟。”牛膝性平味苦酸，歸肝、腎經，可補肝腎、強筋骨、活血祛瘀。共為君藥；黃芪性微溫味甘，歸脾、肺經，可補氣生血、活血壯筋骨。桂枝性熱味辛甘，入心經，根據中醫 “赤入心”的理論, 可助心陽、交心腎、暖腰膝、續筋骨、疏通血脈。二者配伍，可共奏活血祛瘀的作用。桃仁性平味苦，歸心、肝、肺、大腸經，可活血祛瘀。共為臣藥；枳殼性微寒味辛苦，歸脾、胃、大腸經，可破氣消積化痰。茯苓性平味甘淡，歸心、脾、腎經，可利水滲濕、健脾祛痰。檳榔性溫味辛苦，可行氣消積利水、導滯化痰。共為佐藥；白蒺藜性平味辛苦，歸肝經，可平肝疏肝、祛風平顫，為使藥。上述諸藥合用，可滋補肝腎、活血祛瘀、化痰消積。

本研究構建PD陰虛動風證大鼠模型[8]，給敦煌顫震方灌胃干預，并利用IlluminaHi Seq平臺進行測序，對PD大鼠黑質-紋狀體組織進行轉錄組測序，按照差異基因表達變化FDR≤0.01、log2(Fold Change)≥|1|的原則，正常組和模型組(右側黑質/右側紋狀體)之間共篩選出143/149個顯著性差異表達基因，其中78/86個基因上調表達，65/63個基因下調表達。敦煌顫震方組明顯抑制了差異基因的表達富集程度。根據報道，PI3K-Akt信號通路在PD模型小鼠中被激活，抑制體內細胞自噬、促進細胞凋亡[10]。MAPK信號通路激活與氧化應激引起的PD細胞凋亡存在著密切聯系，若能抑制MAPK信號通路的激活則可能抑制神經細胞凋亡[11]。cAMP信號通路中cAMP(Cyclic adenosine monophosphate)作為一個經典的第二信使，參與機體的所有生理和病理活動[12]。cAMP表達水平升高，可能通過促進神經細胞存活、再生、分化，從而保護小鼠的認知功能[13]。TNF信號通路在PD的炎癥病理過程中起著重要作用。在PD 患者腦脊液和黑質-紋狀體系統中，TNF-α表達量較健康對照組增高，提示TNF-α對DA 能神經元造成了損害[14]。近年來，有關cGMP-PKG信號通路信號轉導的知識不斷涌現，cGMP的作用機制可能涉及調節神經炎癥、氧化應激、細胞凋亡、突觸可塑性和認知功能[15]。經過敦煌顫震方治療后，抑制PD模型大鼠上述信號通路的活化，調節細胞自噬、細胞凋亡、神經細胞再生、神經炎癥、氧化應激、突觸可塑性和認知功能等，這可能是敦煌顫震方發揮抗PD作用的機制。還發現氨基酸、蛋白質、維生素B6等代謝途徑與DA能神經元的存活有關。半個世紀以來，DA替代藥物左旋多巴-直是PD的臨床主導用藥，然而該藥長期應用會引起患者癥狀波動和運動障礙[16]。本研究結果顯示，敦煌顫震方可望成為DA能神經元保護劑，可再生與修復變性的DA能神經元，值得進一步研究。