β 欖香烯對脂多糖誘導的腎小管上皮細胞氧化應激和凋亡的影響及作用機制

楊嘉陵 ，谷成杰 ，歐國東

作者單位：1 重慶市雙橋經濟技術開發區人民醫院藥劑科，重慶 400900；2 重慶市巴南區接龍中心醫院藥劑科，重慶 401344；3 重慶市大足區第二人民醫院藥劑科，重慶 402368

腎小管損傷是各種急慢性腎病的主要病理特征，可見于腎臟因缺氧、中毒、缺血再灌注損傷、糖尿病腎病等，腎小管上皮細胞是腎小管損傷的直接靶細胞。研究藥物對腎小管上皮細胞的修復機制對腎損傷病人具有重要意義。

脂多糖可誘導腎小管上皮細胞產生凋亡和氧化應激反應，造成細胞損傷，脂多糖誘導的腎損傷模型為大多研究者所采用。研究表明，β 欖香烯（β-elemene）是具有廣譜抗腫瘤效果，在非腫瘤疾病中具有抗氧化損傷、抗凝血、抗血栓和延緩白內障的作用，且毒副作用小。研究還發現，β 欖香烯可抑制腎小球系膜細胞纖維化，并抑制炎癥反應。但是 β 欖香烯在脂多糖誘導的腎小管上皮細胞（HK-2）中的影響和機制尚不清楚。

本研究于 2018年 1月至 2019年 2月以脂多糖誘導 HK-2 產生的氧化應激損傷為模型，以 β 欖香烯處理的方法來檢測 β 欖香烯對脂多糖誘導的 HK-2損傷和凋亡的影響和作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

腎小管上皮細胞系 HK-2（購自 ATCC）；DMEM 高糖培養基和胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶Trypsin（購自 Gibco 公司）；脂多糖、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（購自 Sigma-Aldrich 公司）；β 欖香烯（購自四川省維克奇生物科技有限公司）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司）；Bcl-2 相 關 X（Bax）抗體、B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）抗體、核因子 E2相關因子 2（Nrf2）抗體、血紅素氧合酶-1（HO-1）抗體和抗 β 肌動蛋白（β-actin）抗體（購自英國 Abcam公司）；活性氧自由基（ROS）和丙二醛檢測試劑盒（購自上海碧云天技術有限公司）；流式法細胞凋亡檢測試劑盒（購自美國 BD 公司）；流式細胞儀（購自美國 BD 公司），顯微鏡、酶標儀（購自美國 Bio-Rad公司），BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（購自江蘇凱基生物技術股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和實驗分組 將腎小管上皮細胞HK-2 培養于含 10 % FBS、1% 青-鏈霉素的 DMEM 高糖培養基中，置于 37 ℃、5% 二氧化碳、濕度 95% 的培養箱中培養，待細胞融合為一層時，消化傳代。

NC 組：空白對照培養基不加藥物；脂多糖組：培養基中加入終濃度 1 μg∕L 的脂多糖，培養 24 h；脂多糖+β 欖香烯組：培養基中加入終濃度 1 μg∕L 的脂多糖培養 24 h，棄培養液，然后加入含不同終濃度 β 欖香烯（2.5 mg∕L、5.0 mg∕L 和 10.0 mg∕L）的 DMEM 高糖培養液培養 24 h。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測細胞存活率 待“1.2.1”分組的 HK-2 細胞培養至對數生長期，收集細胞并進行消化，以每孔2×l0個細胞接種于 96 孔板中，培養細胞至 24 h、48 h、72 h 和 96 h 時，進行 MTT 實驗，每孔加入 20 μL MTT 溶液，培養 4 h 后棄上清，再每孔加入 150 μL DMSO，室溫震蕩 5 min，酶標儀檢測吸光度A 值（490 nm），計算細胞存活率。

1.2.3 流式細胞術測定細胞凋亡率 經脂多糖或∕和 β 欖香烯處理后各組細胞，以 2×10個∕孔接種于 6孔板中，培養 48 h ，棄培養液，消化，離心收集細胞，按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，室溫避光 20 min，流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.2.4 蛋白質印跡法檢測蛋白表達 將對數生長期的各組細胞（NC 組、脂多糖組、脂多糖+β 欖香烯組）進行收集，加入 RIPA 裂解液裂解細胞，超聲破碎，收集蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。將每個樣本進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），以 β-actin 為內參照，分析蛋白水平。

1.2.5 檢測細胞中 GSH-PX、SOD、丙二醛和 ROS 含量 根據“1.2.4”的方法收集細胞，計數，裂解細胞，收集細胞上清液，根據 GSH-PX、SOD、丙二醛和 ROS試劑盒的說明書要求進行檢測，計算細胞裂解上清中各指標含量。

2 結果

2.1 β 欖香烯可提高脂多糖誘導的腎小管上皮細胞HK-2 存活率

結果顯示，與 NC 組［24～96 h 細胞存活率分別為（100.00±3.56），（100.00±4.78），（100.00±3.17），（100.00±5.64），周期蛋白依賴性激酶（CDK）4含量（0.79±0.09），CDK6 含量（0.64±0.05）］相比，脂多糖組的 HK-2 細胞存活率在 24～96 h［（73.65±3.39），（68.24±5.93），（63.52±3.10），（58.27±4.05）］顯著下降 ，CDK4（0.23±0.03）和 CDK6 表達量（0.41±0.05）顯著下降（

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

＜0.001）；與脂多糖組相比 ，β 欖香烯 2.5 mg∕L+ 脂多糖組［（78.42±3.39），（74.63±4.29），（65.39±4.18），（62.37±4.14）］、β 欖香烯 5.0 mg∕L+脂多糖組［（89.43±5.67），（79.64±6.27），（73.64±4.29），（65.37±4.12）］和 β 欖香烯 10.0 mg∕L+脂多糖組［（87.24±5.68），（78.69±5.42），（72.13±4.09），（63.27±4.25）］的細胞存活率增高 ，CDK4［（0.42±0.04），（0.51±0.05），（0.65±0.07）］和CDK6 表達量［（0.51±0.04），（0.56±0.04），（0.62±0.05）］顯著增多（

P

=0.030、0.016、0.003、0.000、0.034、0.023；

P

=0.009、0.000、0.000、0.000、0.008、0.014；

P

=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.002），見圖1。

圖1 不同濃度 β 欖香烯對脂多糖誘導的腎小管上皮細胞存活

2.2 β 欖香烯抑制脂多糖誘導的腎小管上皮細胞HK-2 凋亡

流式細胞術和蛋白質印跡法結果顯示 ，與 NC 組［（4.86±0.62）；（0.64±0.05）；（0.78±0.08）］相比，脂多糖組（27.34±2.68）的 HK-2 細胞凋亡率升高，促凋亡蛋白 Bax 表達量（0.83±0.08）升高，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達（0.37±0.04）降低（

P

＜0.001、

P

＜0.001、

P

＜0.001）；與脂多糖組相比，β欖香烯 2.5 mg∕L+脂多糖組、β 欖香烯 5.0 mg∕L+脂多糖組和 β 欖香烯 10.0 mg∕L+脂多糖組的細胞凋亡率［（25.64±2.89），（23.67±2.24），（18.64±2.08）］和 Bax表 達 量［（0.77±0.06），（0.68±0.06），（0.65±0.06）］逐漸降低 ，Bcl-2 表達量［（0.46±0.04），（0.59±0.07），（0.62±0.07）］逐漸升高（

P

=0.043、0.026、0.019；

P

=0.005、0.001、0.001；

P

=0.001、0.000、0.000），見圖2。

圖2 不同濃度β欖香烯對脂多糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡的影響：A為流式細胞術檢測；B為蛋白質印跡法檢測

2.3 β 欖香烯促進脂多糖誘導的 HK-2 細胞產生GSH-PX 和 SOD

與NC組［（82.91±6.18），（36.76±2.68）］相比 ，脂多糖組的 HK-2 細胞中 GSH-PX（57.23±3.17）和 SOD（21.13±1.34）水平 降低（

P

＜0.001、

P

=0.003）；與 脂 多 糖組相比 ，β 欖香烯 2.5 mg∕L+脂多糖組、β 欖香烯 5.0 mg∕L+脂多糖組和 β 欖香烯 10.0 mg∕L+ 脂多糖組 HK-2 細胞中 GSH-PX［（65.37±2.54），（70.26±4.36），（72.46±3.64）］和 SOD［（25.69±1.67），（27.67±1.65），（28.96±1.85）］水平增高（

P

=0.039、0.017、0.009；

P

=0.025、0.018、0.012）。

2.4 β 欖香烯對脂多糖誘導的腎小管上皮細胞丙二醛和 ROS 的影響

與 NC 組［（1.00±0.06），（1.00±0.09）］相比，脂多糖組的 HK-2 細胞中丙二醛（1.62±0.13）和 ROS（3.34±0.32）水平升高（

P

=0.001、

P

＜0.001）；與脂多糖組相比 ，β 欖香烯 2.5 mg∕L+脂多糖組 、β 欖香烯 5.0 mg∕L+脂多糖組 和 β 欖香烯 10.0 mg∕L+ 脂多糖組 HK-2 細胞中丙二醛［（1.43±0.08），（1.35±0.11），（1.31±0.09）］和 ROS［（2.34±0.21），（1.85±0.12），（1.61±0.11）］水平逐漸降低（

P

=0.024、0.026、0.012；

P

=0.006、0.000、0.000）。

2.5 β 欖香烯對脂多糖誘導的腎小管上皮細胞Nrf2/HO-1 信號通路的影響

蛋白質印跡法結果顯示 ，與 NC 組［（0.79±0.06），（0.62±0.05）］相比 ，脂多糖組的 HK-2 細胞中 Nrf2（0.33±0.04）和 HO-1（0.27±0.03）表達水平顯著降低（

P

＜0.001、

P

＜0.001）；與脂多糖組相比，β 欖香烯 2.5 mg∕L+脂多糖組、β 欖香烯 5.0 mg∕L+脂多糖組和 β 欖香烯 10.0 mg∕L+脂多糖組 HK-2 細胞中 Nrf2［（0.42±0.04），（0.57±0.06），（0.63±0.06）］和 HO-1［（0.35±0.03），（0.43±0.05），（0.45±0.05）］表達水平逐漸升高（

P

=0.018、0.007、0.000；

P

=0.033、0.002、0.000），見圖3。

圖3 不同濃度 β 欖香烯對脂多糖誘導的腎小管上皮細胞 Nrf2∕HO-1 信號通路的影響

3 討論

腎小管細胞損傷（包括細胞壞死和凋亡）引起細胞功能紊亂導致腎損傷，慢性進展性腎損傷通常會進展至腎纖維化或腎衰竭。氧化應激產生的活性分子 ROS 或脂質氧化產物丙二醛通常引起細胞凋亡，而氧化應激及其引發的細胞凋亡是多種腎病的致病因素。

脂多糖可導致包括肺、肝和腎等多種細胞產生氧化應激，造成細胞炎癥反應引起急性損傷。脂多糖誘導的細胞損傷模型相對簡單，也被大多數研究者認可。本研究通過建立腎小管上皮細胞 HK-2 的脂多糖模型，發現脂多糖可抑制 HK-2 細胞存活并誘導細胞凋亡，抑制細胞中 GSH-PX 和 SOD 的表達，促進細胞大量產生丙二醛和 ROS，造成細胞氧化應激損傷。

β 欖香烯是中藥溫莪術中的一種萜類抗腫瘤活性成分，β-欖香烯可誘導非小細胞肺癌（NSCLC）細胞凋亡和抑制膀胱癌。β 欖香烯（20、40 mg∕L）通過 β - 連環蛋白（β -catenin）的失活下調 Wnt∕β -catenin 信號通路，從而抑制促炎性介質和細胞因子的產生，在脂多糖誘導的炎癥中起保護作用。β欖香烯（50 μmol∕L）還可通過減輕血管氧化應激水平和抑制促炎細胞因子的產生，減輕 ApoE-∕-小鼠動脈粥樣硬化病變的大小和增強斑塊穩定性。β 欖香烯（80、120、160 mg∕L）還可通過抑制結締組織生長因子（CTGF）和纖維連接蛋白（FN）的表達，抑制轉化生長因子-β（TGF-β）誘導的腎小球系膜細胞的纖維化。β 欖香烯對腎小管上皮細胞的影響還不清楚。本研究發現，2.5 mg∕L、5 mg∕L 和 10 mg∕L 的 β欖香烯可以抑制脂多糖誘導的 HK-2 凋亡，提高細胞存活率，減輕脂多糖誘導的 HK-2 細胞氧化應激損傷，以上述研究結果類似，且所需 β 欖香烯的濃度相對低一些。

Nrf2∕HO-1 信號通路是人體內重要的內源性防御體系，在多種組織（心、腦、肝、腎和神經組織）中可被激活，是抗氧化應激損傷的關鍵因子。當機體進入氧化應激狀態時，Nrf2 可誘導 HO-1 過表達，阻止氧化反應、抗炎和抑制細胞凋亡。本研究結果表明，脂多 糖 抑制 HK-2 細 胞中 Nrf2 和 HO-1 的表達 ，抑 制 Nrf2∕HO-1 信號通路 ，而 β 欖香烯可促進Nrf2 和 HO-1 的表達，說明 β 欖香烯可能通過激活Nrf2∕HO-1 信號通路，保護 HK-2 細胞減輕脂多糖誘導的氧化應激損傷。

本研究發現，在脂多糖誘導的 HK-2 中，β 欖香烯可能通過激活 Nrf2∕HO-1 信號通路，抑制細胞凋亡，提高細胞存活率，從而減輕脂多糖誘導的氧化應激損傷。β 欖香烯在腎損傷等腎病中可能具有治療作用。本研究只進行了體外細胞的研究，后續將根據條件進行動物體內模型試驗，進一步確認 β 欖香烯在治療腎損傷等腎病的臨床意義。