基于網絡藥理學及分子對接技術探討六味地黃丸治療胃腺癌的作用機制研究

劉亞琪 ，王逸驍 ，胡作為 ，鄭承紅

作者單位：1 武漢市中心醫院中醫科，湖北 武漢 430065；2 襄陽市中醫醫院內科，湖北 襄陽 441000；3 湖北中醫藥大學中醫臨床醫學院，湖北 武漢 430065

胃腺癌是最具侵襲性的惡性腫瘤之一，被認為是全球第五大常見癌癥和第三大癌癥死亡原因，胃腺癌預后不佳，目前手術治療仍是其主要治療手段，雖然放療、化療、免疫治療、靶向治療改善了胃腺癌病人的預后，但晚期胃腺癌病人的中位生存期仍不超過 12 個月，由于其治療手段的局限性，且部分病人難以耐受手術及放化療，西醫治療帶來的副反應等一系列問題，越來越多的胃腺癌病人尋求中醫治療。六味地黃丸是以“三補三瀉”為特征的滋陰補腎的名方，胃腺癌病人由于手術耗氣傷陰或腫瘤在體內長期消耗，或各種治療引起正氣虧損，陰血不足，最終導致胃陰不足，機體虛弱，無以耐受治療及腫瘤的消耗。腎之氣陰是一身元陰元陽的根本，滋陰補腎，從先天之本養后天消耗之氣陰，培本固元，可對胃腺癌病人起到積極的效果。臨床研究顯示，六味地黃丸可抑制多種腫瘤細胞的活性，且可改善晚期胃癌病人生存質量 ，延長其生存期。

網絡藥理學是一種基于系統生物學的理論，對選取的特點信號節點（Nodes）進行的多靶點藥物分子設計及分析的新學科。目前多數網絡藥理學研究的是單藥或對藥成分，很少有針對中藥復方的研究，因此，本研究采用網絡藥理學研究方法，對六味地黃丸抗胃腺癌的主要有效成分、靶點及通路進行系統闡述，以期為后續實驗及臨床用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥物化學成分的構建

依托中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）（https：∕∕old.tcmsp-e.com∕tcmsp.php）檢索六味地黃丸中（熟地黃、牡丹皮、澤瀉、山茱萸、山藥、茯苓）所有化學成分信息，其中熟地黃有關的化學成分 76 個，丹皮有關的化學成分 55個，澤瀉有關的化學成分 46 個，山茱萸有關的化學成分 226 個，山藥有關的化學成分 71 個，茯苓有關的化學成分 34 個。

1.2 口服利用度（OB）和類藥性（DL）篩選

藥物化學成分篩選選擇 OB≥30%，DL≥0.18 作為有效成分的篩選條件，通過條件篩選，共有 69 個化學成分符合條件，其中熟地黃 2 個，牡丹皮 11 個，澤瀉 10個，山茱萸 20 個，山藥 16 個，茯苓 15 個，其中相同的化合物有 5 個，故共有 69 個有效成分。

1.3 藥物靶點及疾病靶點的建立

通過 TCMSP 平臺尋找 69 個有效成分對應的靶點。并在 Genecard（https：∕∕www.genecards.org∕）、OMIM（https：∕∕omim.org∕）、TTD（http：∕∕db.idrblab.net∕ttd∕）、Drugbank（https：∕∕www.drugbank.com∕）、DisGeNET（https：∕∕www.disgenet.org∕）數據庫中檢索胃腺癌相關靶點并進行整合，從而構建胃腺癌相關靶點集合。

1.4 藥物靶點及疾病靶點的匹配

將篩選后的藥物有效成分所對應的靶點與疾病相關靶點進行匹配 ，匹配所得靶點在 STRING 數據庫（https：∕∕string-db.org∕）中建立蛋白質相互作用（PPI）網絡圖。同時運用 Cytoscape3.6.2（http：∕∕www.cytoscape.org∕）進行藥物成分、靶點之間的網絡拓撲分析。

1.5 功能富集分析與通路分析

為了說明中藥有效成分對應的預測靶點在基因功能和通路中的作用 ，依托生物學信息注釋數據庫 Metascape（http：∕∕metascape.org），以

P

＜0.01 作為具有統計學差異的篩選條件，對獲取的靶點進行基因本體（GO）富集和京都基因和基因組數據庫（KEGG）通路注釋分析 。 并將藥物疾病靶點及 KEGG 通路導入 Cytoscape3.6.2 軟件中進行分析。

1.6 分子對接

通過 pubchem 網站（https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov∕）檢索獲取核心化合物的3D結構，采用 AutoDock vina1.1.2 軟件對 PPI 網絡中度值（degree）前 5 的靶點蛋白與其原配體及核心化合物進行分子對接。通過對接分數值（docking score）對成分與靶點之間的結合活性進行評價。

1.7 統計學方法

OB（口服生物利用度）使用 TCMSP 內部軟件 OBioavail 1.1 計算，OB≥30% 是確定生物活性分子作為治療藥物的指標。DL（類藥性）用于評估預期化合物的“類藥”程度，化合物的“類藥”水平為 0.18，這是傳統中草藥中“類藥”化合物的選擇標準。KEGG 及 GO 富集過程中的

P

值是基于超幾何分布計算的，以

P

＜0.01 作為差異有統計學意義的篩選條件。分子對接 AutoDock 軟件評價受體和配體之間的匹配情況，結合能≤-5.0 kcal∕mol 為分子與靶點結合性較好。

2 結果

2.1 六味地黃丸有效成分

通過在 TCMSP 數據庫內檢索 ，獲得全方中的藥物化學成分共 508 個，將508 個化學成分根據 OB≥30%，DL≥0.18 的標準進行篩選后共得到 69 個有效成分，見表1。

表1 六味地黃丸有效成分列表

續表1 六味地黃丸有效成分列表

2.2 六味地黃丸作用靶點

根據 TCMSP 數據庫中的有效成分靶點信息，共收集到六味地黃丸中有效成分的相關作用靶點共 506 個，其中丹皮 214 個、茯苓 23 個、山藥 122 個、山茱萸 108 個、熟地 30 個和澤瀉 9 個 。 從 Genecard、OMIM、TTD、Drugbank、Dis-GeNET 等數據庫中檢索胃腺癌相關靶點后 進行整合 ，共獲得 6198 個疾病相關靶點 。 將藥物相關靶點與疾病相關靶點進行對比分析，取交集可以得到156 個六味地黃丸抗胃腺癌的可能作用靶點。

2.3 PPI 網絡的構建

在 STRING 數據庫中構建上述 156 個靶點的蛋白質相互作用網絡（PPI）。由于單獨孤立的蛋白與其他蛋白無相互作用，均不在蛋白互作網絡中體現，故此網絡中共包含 147 個節點，1 048 條邊。節點大小及顏色由 degree 的大小表示，節點越大對應的 degree 越大，顏色由紅色到藍色，對應的 degree 越大（圖1）。對 PPI 進行拓撲特征分析，選取在“ 度值 ”（degree），“ 中介中心性 ”（betweenness），“ 接近中心性 ”（closeness）3 個參數均大于中位數的點作為核心靶點，連續進行 3 次篩選后，得到20 個重要核心靶點 ，具體包括 JUN（degree=48，closeness=0.857） ，MAPK1 （degree=52，closeness=0.837），IL-6（degree=52，closeness=0.800），AKT1（degree=64，closeness=0.783），MAPK8（degree=53，closeness=0.783），VEGFA（degree=43，closeness=0.766），MYC（degree=40，closeness=0.735），ESR1（degree=33，closeness= 0.692），EGF（degree=39，closeness=0.692），HSP90AA1（degree=42，closeness=0.679），RELA（degree=34，closeness=0.679），FOS （degree=29，closeness=0.667），EGFR（degree=35，closeness=0.667），CCND1（degree=37，closeness=0.667），AR（degree=29，closeness=0.667），MMP9（degree=35，closeness=0.667） ， STAT1 （degree=29， closeness=0.667），IL1B（degree=35，closeness=0.655），PPARG（degree=25，closeness=0.655），PTGS2（degree=32，closeness=0.655）。基于 20 個重要核心靶點，根據相關有效成分，進一步構建藥物有效成分-核心靶點網絡 ，通 過 Cytoscape 網絡圖分析可以發現 ：丹皮通過quercetin（MOL000098）、kaempferol（MOL000422）、5-［［5-（4-Methoxyphenyl）-2-furyl］methylene］barbituric acid（MOL007374）作用于 20 個核心靶點發揮作用 ，山藥通過 diosgenin（MOL000546）、AIDS180907（MOL005465）、（-）-taxifolin（MOL001736）、Kadsurenone（MOL000322）、Stigmasterol（MOL000449）對PTGS2、RELA、VEGFA、AKT1、ESR1、HSP90AA1、AR 核心靶點發揮作用，山茱萸通過 Tetrahydroalstonine（MOL008457）、beta-sitosterol（MOL000358）、Hydroxygenkwanin （MOL005530） 、 Mandenol（MOL001494）、Cornudentanone（MOL005503）、2，6，10，14，18-pentamethylicosa-2，6，10，14，18-pentaene（MOL005481）對 AR、HSP90AA1、PPAGR、PTGS2、JUN 等核心靶點發揮作用 ，茯苓和熟地分別通過hederagenin （MOL000296） 及 Stigmasterol（MOL000449）對 PTGS2 發揮作用 。 這些藥物有效成分及靶點的相互作用，體現了六味地黃丸多成分多靶點抗胃腺癌的作用關系。見圖2。

2.4 GO 富集分析

將六味地黃丸活性成分預測出的 156 個作用靶點通過 Metascape 生物分子功能注釋系統進行 GO 富集分析 ，包括 GO BP 生物過程分析（biological process）、GO MF 分子功能（molecular function）分析 和 GO CC 細胞組分分析（cellular component）。在其中每項排名前 10 的條目，見表2。

其中 GO BP 中 response to inorganic substance，response to toxic substance，cytokine-mediated signaling pathway 靶點富集較集中 ；GO MF 中 protein kinase binding，transcription factor binding，protein domain specific binding 靶點相對集中富集；在 GO CC中與 membrane raft，transcription factor complex，perinuclear region of cytoplasm 相關性最大。

2.5 KEGG 通路富集分析

為了進一步揭示六味地黃丸抗胃腺癌的潛在作用機制，通過對 156 個候選靶點進行 KEGG 通路富集分析，依據

P

＜0.01 進行篩選共獲得 36 條相關通路，涉及腫瘤、代謝、免疫、信號轉導、細胞凋亡等多個方面，將 36 個通路根據 P值由小到大進行排序 。 排在前5位的依次是hsa05200：Pathways in cancer 信號通路、hsa04933：晚期糖基化終末產物-糖基化終末產物受體（AGERAGE） in diabetic complications 信號通路 、hsa04668：腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、hsa04066：缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路 、hsa01524：Platinum drug resistance 信號通路，將獲得的靶點及前 20項信號通路導入 Cytoscape 3.6.2 進行分析 ，構建靶點-通路網絡 ，根據 degree 排序 ，發現 KEGG 通路富集前 5 位的依次是腫瘤信號通路（hsa05200，degree=49）、AGE-RAGE 信號通路（hsa04933，degree=27）、TNF 信號通路（hsa04668，degree=22），HIF-1 信號通路 （hsa04066，degree=20） 、鉑耐藥信號通路（hsa01524，degree=16），提示六味地黃丸越可能通過這些通路發揮作用。

2.6 分子對接

將 PPI 網絡中排名前 5 的靶點蛋白分別與槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）、薯蕷皂苷（Diosgenin）和四氫鴨腳木堿（Tetrahydroalstonine）進行分子對接驗證，以對接分數來評價核心成分與靶點之間的相互作用，若結合能＜0，表明配體分子均能和受體蛋白自發地結合，結合能＜-5.0 kcal∕mol，表明其結合性好，結合能越小對接越好。然后將 5 個靶點蛋白與其原配體進行對接，得到的對接分數作為參照，用于評價 4 個核心成分與靶點蛋白的對接結果，見表3。從結果可以看到，4 個核心成分與靶點蛋白均能較好的對接，JUN 與山柰酚的結合優于原配體，MAPK1、IL-6、AKT1、MAPK8 與薯蕷皂苷結合優于原配體。

表2 六味地黃丸活性成分預測出的 156 個作用靶點 GO 富集分析

表3 靶點蛋白與六味地黃丸中 4 個核心成分及原配體的對接分數∕（kcal∕mol）

將前五個靶標基因結合最好的化合物進行分子對接展示 ，詳見圖3。 其中山柰酚（kaempferol）與JUN 結合最好，薯蕷皂苷（diosgenin）與 MAPK1、IL-6、AKT1、MAPK8 結合最優 。 圖3A 為 kaempferol 和JUN 之間的結合模式，氨基酸殘基 Ser155、Asn156、Lys55 與 kaempferol 配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基 Val158、Ala113、Met111、Asp112、Ile32、Ala53、Val40、Gly35、Leu168 與 kaempferol 配體小分子形成疏水相互作用 ，圖3B 為 diosgenin 和 MAPK1之間的結合模式，氨基酸殘基 Thr110、Glu109、

Ile31、Gly32、Val39、Glu33、Gly34、Tyr36、Asp167、Asn154、Leu156、Ser153、Met108、Asp111、Lys114 與diosgenin 配體小分子形成疏水相互作用，圖3C 為diosgenin 和 IL-6 之間的結合模式 ，氨基酸殘基Asn63、Pro65、Glu93、Tyr97、Thr143、Leu147、Lys150與 diosgenin 配體小分子形成疏水相互作用，圖3D 為diosgenin 和 AKT1之間的結合模式 ，氨基酸殘基Gly311 與 diosgenin 配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基 Phe161、Tyr160、Gly162、Gly159、Val164、Asp292、Lys276、Leu295、Thr312 與 diosgenin配體小分子形成疏水相互作用，圖3E 為 diosgenin 和MAPK8 之間的結合模式，氨基酸殘基 Lys153 與 diosgenin 配體小分子形成氫鍵相互作用，基酸殘基Asp169、Ser155、Asn114、Leu168、Ser34、Ile32、Gly33、Val40、Lys55、Gly35、Gln37、Ala36、Asp151 與diosgenin 配體小分子形成氫鍵相互作用。

圖1 156個六味地黃丸抗胃腺癌的可能作用靶點的蛋白質相互作用網絡 圖2 六味地黃丸有效成分-抗胃腺癌核心靶點網絡 圖3 六味地黃丸活性化合物成分和抗胃腺癌活性蛋白質相互作用分析：3A為山柰酚和JUN之間的結合模式；3B為薯蕷皂苷和MAPK1之間的結合模式；3C為薯蕷皂苷和IL-6之間的結合模式；3D為薯蕷皂苷和AKT1之間的結合模式；3E為薯蕷皂苷和MAPK8之間的結合模式

3 討論

六味地黃丸源于宋代醫學家錢乙的《小兒藥證直訣》，由熟地黃、丹皮、山藥、山茱萸、澤瀉、茯苓 6味藥組成，是滋補腎陰的名方。近代研究表明，六味地黃丸具有防治胃癌的作用。如石金鳳研究發現中、高劑量六味地黃丸聯合 5-氟尿嘧啶（5-Fu）可顯著抑制胃癌細胞的生長，且可減輕 5-Fu 注射液對胃癌荷瘤鼠的毒副作用。江良縣通過臨床研究發現，六味地黃丸聯合 FOLFOX6 方案可延長晚期胃癌病人的生存期，降低化療毒副反應，提高化療療效。簡詠梅等報道六味地黃丸可顯著降低胃癌相關炎性因子的表達而降低糖尿病小鼠胃癌的發生風險。但六味地黃丸治療胃癌的作用機制及有效成分尚不明確。因此，本研究采用網絡藥理學方法探討六味地黃丸抗胃腺癌的作用機制，從全方六味中藥獲得 508 個成分，按 OB≥30%，DL≥0.18 篩選，共獲取 69 個有效成分，將有效成分靶點與疾病相關靶點進行比對后，得到 156 個六味地黃丸抗胃腺癌的可能作用靶點。對其進行拓撲分析發現 20 個重要核心靶點 ，依次是 JUN、MAPK1、IL-6、AKT1、MAPK8、VEGFA、MYC、ESR1、EGF、HSP90AA1、RELA、FOS、EGFR、CCND1、AR，MMP9、STAT1、IL1B、PPARG、PTGS2。在藥物有效成分-靶點網絡中對 20個核心靶點再分析，根據 degree 降序可發現其中槲皮 素（quercetin，MOL000098）與18個核心靶點相關，山柰酚（kaempferol，MOL000422）與 9 個核心靶點相關，薯蕷皂苷（diosgenin，MOL000546）與4個核心靶點有關 ，四氫鴨腳木堿（Tetrahydroalstonine，MOL008457）與 4 個核心靶點有關。推測槲皮素及山柰酚是六味地黃丸抗胃腺癌的主要成分，其次是薯蕷皂苷及四氫鴨腳木堿。

進一步通過 GO 功能富集分析，可以發現六味地黃丸的作用涉及多個生物學過程，并更可能通過細胞毒性、氧化應激、代謝及凋亡功能發揮其抗胃腺癌的作用。通過 KEGG 通路富集分析，我們共發現 36 條相關信號通路，其中 Cancer 信號通路、AGERAGE 信號通路、TNF 信號通路富集較集中，其次是HIF-1信號通路及 Platinum drug resistance 信號通路，推測這些通路可能是六味地黃丸發揮作用的主要信號通路。進一步通過有效成分-靶點-通路富集分析發現，槲皮素、山柰酚、薯蕷皂苷和四氫鴨腳木堿主要通過 AGE-RAGE 信號通路和 TNF 信號通路發揮作用。AGE-RAGE 信號通路在胃癌的發生、發展和轉移中發揮著重要作用，研究表明，槲皮素能通過抑制 RAGE 基因的表達，提升細胞凋亡與自噬作用 ，增加腫瘤細胞的死亡率達到抗癌的功效。TNF 信號通路中的多個蛋白在胃癌細胞的增殖、生存等過程中起著重要作用，研究表明槲皮素和山柰酚均可通過調節 TNF 等凋亡基因的表達抑制腫瘤的增殖，薯蕷皂苷可通過上調 TNFR1∕TNF-α 的 mRNA 的表達顯著抑制胃癌細胞 HGC-27的增殖。以上的結果表明，熟地、丹皮、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉可通過多個成分對胃腺癌多個靶點及多條通路作用，不局限于單一成分、單一靶點及單一通路。槲皮素、山柰酚、薯蕷皂苷及四氫鴨腳木堿可能是六味地黃丸的主要有效成分，可通過多個靶點對 Cancer 信號通路 、AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路發揮作用。六味地黃丸的其他有效成分也參與調控了多個靶點及通路，體現了六味地黃丸多成分、多靶點、多通路協同作用抗胃腺癌的機制。根據以上結果，我們發現在鉑耐藥通路中同樣有多個靶點富集，這與目前臨床研究六味地黃丸聯合化療治療晚期胃癌可抑制腫瘤生長，提高化療療效，改善病人生存質量不謀而合，值得今后根據有效成分、作用靶點及信號通路進一步研究。

綜上所述。本研究從網絡藥理學角度對六味地黃丸治療胃腺癌的有效成分、核心靶點、作用通路進行了分析，并基于分子對接技術模擬其可能分子作用機制，為下一步實驗研究六味地黃丸治療胃腺癌提供了理論依據和線索。當然，由于本研究是基于現有數據庫進行的理論推測，其中可能存在假陰性或者假陽性的結論。均有待于進一步的實驗驗證。