一例豬圓環病毒2型和豬葡萄球菌混合感染導致仔豬滲出性皮炎的診斷與防控

張 維

（湖南省汨羅市畜牧水產服務中心，湖南 汨羅 414400）

豬圓環病毒2型（PCV2）屬于圓環病毒屬，是迄今為止發現的最小的DNA病毒之一，但該病原對宿主的致病性很高[1]。斷奶仔豬多系統衰竭綜合征主要由PCV2感染引起，其臨床癥狀包括咳嗽、精神萎靡和呼吸困難等，但單獨感染的病死率較低[2]。值得注意的是，PCV2感染可導致病畜出現免疫抑制，這導致其它病原的混合感染較嚴重，給養殖戶造成巨大的經濟損失，同時也導致疫病的診斷與防控較為困難[3]。豬葡萄球菌是引起仔豬滲出性皮炎的主要病原，仔豬感染該病原的主要臨床癥狀包括消瘦、發熱、皮膚表面有紅斑或潰瘍等，影響患豬采食和健康成長，嚴重時可導致死亡[4]。豬葡萄球菌屬于機會致病菌，該病原廣泛存在于豬體表，其感染健康豬群一般不發病，但豬群因病原感染或其它因素造成抵抗力下降時會導致該病相關臨床癥狀出現，故在臨床上該病主要是散發，但我們也不能忽視其對生豬養殖造成的危害與損失[5]。

2020年9月初，湖南汨羅市某豬場部分仔豬持續發病，臨床癥狀主要包括滲出性皮炎、咳喘和體溫升高等，病死豬體表末端（如耳朵和四肢等）發紺，剖檢發現淋巴結腫大、腎臟有明顯出血點，遂該企業負責人采集病死豬肺臟、腎臟、淋巴結等組織樣品送至汨羅市畜牧水產服務中心進行病原檢測，以期為相應的疫病防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源

豬病變組織（肺臟、淋巴結及腎臟）由汨羅市某豬場提供。豬場獸醫無菌采集組織樣品后進行標記，低溫送至汨羅市畜牧水產服務中心進行檢測。

1.2 主要材料及試劑

動物組織DNA/RNA基因組提取試劑盒購自于賽默飛科技有限公司，cDNA反轉錄試劑盒、2×Taq PCR mix及DL 5 000 DNA Marker等產品均購自于Tankera；藥敏紙片及相應細菌分離培養基為杭州微生物試劑有限公司產品。

用于檢測豬瘟病毒（CSFV）、PCV2、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）、豬藍耳病病毒（PRRSV）及豬乙腦病毒（JEV）的特異性引物序列參考相關文獻[6]，以上引物及細菌檢測16S rRNA基因序列通用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 病毒檢測

用滅菌眼科剪及手術刀切取少量組織，剪碎后置于離心管內，加入少量滅菌PBS溶液和鋼珠后勻漿。將混合物高速離心，取200 μL上清液用于組織DNA/RNA基因組提取，其具體操作及注意事項均嚴格參考動物組織DNA/RNA基因組提取試劑盒提供的說明書，提取的基因組保存于-80 ℃，采用cDNA反轉錄試劑盒將基因組中的RNA反轉錄為cDNA，相應的產物保存于-20 ℃，待檢。

采用PCR對組織樣品中病原核酸進行檢測，其PCR反應體系包含2×PCR mix 10.0 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA/cDNA模板1.0 μL及雙蒸水8.0 μL。反應條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環；72 ℃ 5 min。每次PCR反應均設置陽性對照和陰性對照，其中陽性對照為檢測體系相應陽性樣品核酸，陰性對照為雙蒸水。PCR反應結束后取5.0 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 細菌分離及鑒定

1.4.1 細菌分離及革蘭氏染色鑒定 用滅菌接種環蘸取肺臟病變組織液接種于普通瓊脂培養基表面，37 ℃恒溫箱內培養18 h后觀察培養基表面是否生長菌落，將單一菌落進行革蘭氏染色，鏡檢。

1.4.2 細菌16S rRNA基因序列擴增及分析 取單一菌落在營養肉湯中擴增，在37 ℃環境下震蕩12 h，其后用商業化試劑盒提取細菌基因組DNA。以基因組DNA為模板，其PCR體系和反應條件與上述一致。PCR反應結束后取5 μL產物進行瓊脂糖凝膠電泳，將陽性產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。將返回序列進行拼接，將序列粘貼在NCBI進行核苷酸序列BLAST，分析該菌株序列與NCBI收錄不同病原序列的核苷酸序列同源性。

1.5 藥物敏感試驗

采用K-B擴散法對分離菌進行藥敏試驗：將擴增菌液稀釋至0.5麥氏標準濁度，取50 μL菌液涂布在普通瓊脂培養基表面，待菌液稍干后便可貼上16種含不同抗生素的紙片，每個培養基表面貼4個，將平板置于37 ℃恒溫箱內培養24 h，最后用卡尺測量不同紙片的抑菌圈直徑，根據說明書判定標準對結果進行統計和分析。

2 結果

2.1 病毒檢測結果

通過PCR法分別對組織樣品中PCV2、PRV、PPV、CSFV、PRRSV和JEV核酸進行檢測，發現被檢測樣品中僅PCV2核酸陽性（圖1），未檢出其它病原核酸。

圖1 PCR擴增產物凝膠電泳結果

2.2 細菌分離及革蘭氏染色鑒定結果

將組織液接種于普通瓊脂培養基表面，18 h后發現平板表面生長出濕潤、光滑的圓形菌落；進一步革蘭氏染色結果發現該菌為革蘭氏陽性菌，為葡萄狀排列的球菌（圖2）。

圖2 分離菌株革蘭氏染色鏡檢結果

2.3 分離菌16S rRNA基因序列擴增及分析

隨機挑選3個單一菌落在營養肉湯中擴增，分別提取基因組DNA后，以通用引物16S rRNA-F、16S rRNA-R擴增其目的序列。PCR產物凝膠電泳結果如圖3所示，3個菌株擴增PCR產物大小均為1 600 bp左右，與預測大小基本一致。將3個菌株PCR產物進行測序及拼接后，在NCBI網站進行BLAST對比分析，結果發現3個菌株序列與GenBank收錄的豬葡萄球菌分離株（登陸號：CP030020.1）對應序列同源性均高于99.8%，與其它菌株對應序列同源性均低于98.0%，提示可將本次分離的菌株鑒定為豬葡萄球菌。

圖3 菌株16S rRNA序列PCR擴增產物凝膠電泳結果

2.4 分離菌藥敏試驗結果

進一步對分離菌株進行藥敏試驗，結果發現該菌株對頭孢唑林、頭孢曲松、環丙沙星、慶大霉素、氟苯尼考、利福平、復方新諾明、萬古霉素和新生霉素敏感，對頭孢克肟、氨芐西林、青霉素和氨曲南抗生素耐藥；對卡那霉素、氯霉素和氧氟沙星則中度耐藥。

3 討論

近年來，我國生豬養殖水平不斷提高，隨著養殖業對烈性傳染病防控意識的提高，目前對豬場豬瘟、偽狂犬病等危害嚴重的傳染病得到有效控制。然而，可導致豬群慢性消耗性疾病的病原仍然廣泛存在，其中PCV2可感染不同發育階段豬群，是導致斷奶仔豬多系統衰竭綜合征的主要病原之一，該病的流行對豬群健康造成巨大威脅[1]。此外，PCV2也是作為原發性感染導致繼發感染PRRSV、豬鏈球菌、豬葡萄球菌等的主要病原，這無疑給臨床診斷與疾病治療帶來了巨大的挑戰。

本研究對汨羅市某規模化豬場疫情進行病因診斷，在組織中檢測出PCV2核酸陽性，同時分離出一株豬葡萄球菌，結合臨床診斷結果最終確診該場發生疫情主要是由PCV2和豬葡萄球菌混合感染所致，進一步細菌耐藥性試驗結果表明，本次分離菌株對頭孢唑林、頭孢曲松、環丙沙星、慶大霉素和新生霉素等多種藥物敏感，這為后續該場對此病的防治提供了科學依據。