彌漫大B細胞淋巴瘤中Wnt通路相關蛋白的表達及預后危險因素分析

趙東陸，邢 琦，宋 航

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是臨床上常見的造血系統惡性腫瘤之一，具有侵襲性高、轉移迅速等特點[1]。Wnt信號通路在腫瘤細胞增殖及惡性轉化過程中發揮重要作用。NKD1和β-catenin作為Wnt信號通路活化的關鍵因子，其異常表達與腫瘤進展密切相關[2]。Cyclin D1是Wnt通路的下游靶基因，Cyclin D1高表達可促進癌細胞的增殖和遷移[3]。本實驗擬分析NKD1、β-catenin和Cyclin D1在DLBCL中的表達，并探討三者表達與DLBCL臨床病理特征的關系及預后評估的應用價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2010年3月～2016年2月黑龍江省哈爾濱市第一醫院收治的80例經病理學證實的DLBCL組織標本。所有入選患者在術前均未行放、化療和其他治療，且3年隨訪資料完整。根據中心母細胞數量確定FL分級，所有患者均為FL3級。80例DLBCL按照Ann Arbor分期標準[4]：Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ+Ⅳ期41例；參照Hans免疫亞型分類標準：生發中心B細胞(GCB)亞型38例，非生發中心(non-GCB)亞型42例；按國際預后指數(IPI)評分：0～2分(中低危組)35例，3～5分(中高危組)45例；根據發病部分是否侵犯結外器官分為：淋巴結內45例，侵犯結外器官35例。另選取同期淋巴結良性增生組織45例。DLBCL患者術后接受R-CHOP標準方案治療，并均以電話、門診等方式進行隨訪3年，記錄患者總生存期(overall survival, OS)，OS定義為自確診后至隨訪結束或死亡時間。

1.2 方法所有標本均經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋、脫水、脫蠟、水化、抗原修復、滴加抗體、DAB顯色、復染、封固。免疫組化染色采用SP法，試劑盒購自美國Abcam公司。兔抗人NKD1單克隆抗體、羊抗人β-catenin單克隆抗體和Cyclin D1單克隆抗體均購自北京奧維亞生物公司。DAB顯色試劑盒購自美國Sigma公司。

1.3 判斷標準鏡下觀察制備好的切片，以細胞內出現棕黃色顆粒為陽性。由2名病理科醫師采用雙盲法獨立進行評估，每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(400×)，每個視野內計數100個細胞中陽性細胞數，并求出平均值作為該患者的陽性細胞數。將所有患者陽性細胞數的平均值作為閾值，大于該閾值為陽性，反之則為陰性。

1.4 數據庫在線分析采用基因表達譜數據動態GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析NKD1、β-catenin、Cyclin D1在DLBCL中的表達(數據來源于HiSeq RNA-Illumina HiSeq 2000 RNA Sequencing平臺)，重點分析TCGA數據庫和GTEx項目來源的47例DLBCL和337例正常組織中NKD1、β-catenin、Cyclin D1表達。

1.5 統計學分析采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，分類資料用百分比表示，采用χ2檢驗進行分析；等級變量之間的相關性采用Spearman相關性分析；生存分析應用Kaplan-Meier方法，應用Cox回歸分析預后影響因素，以雙側檢驗P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中NKD1、β-catenin、Cyclin D1的表達3種蛋白在不同組織中均呈彌漫性分布，NKD1、β-catenin、Cyclin D1蛋白陽性淋巴細胞數分別為(18.93±3.48)、(29.78±5.39)、(32.38±6.47)個，以上述各組結果為閾值作為判定陽性細胞的標準。

NKD1在DLBCL組織中的陽性率為18.75%，明顯低于淋巴結良性增生組織(75.56%)，差異有統計學意義(P<0.05)；β-catenin和Cyclin D1在DLBCL組織中的陽性率分別為78.75%、72.50%，均明顯高于淋巴結良性增生組織(均為0)，差異有統計學意義(P<0.0.5，表1，圖1、2)。

表1 不同組織中NKD1、β-catenin、Cyclin D1的表達[n(%)]

①A①B①C②A②B②C

2.2 GEPIA數據庫分析NKD1、β-catenin、Cyclin D1表達GEPIA分析TCGA數據庫和GTEx項目來源的數據發現，DLBCL組織中的NKD1水平低于正常組織，β-catenin和Cyclin D1水平均高于正常組織(P<0.05，圖3)。

圖3 NKD1、β-catenin、Cyclin D1在彌漫大B細胞淋巴瘤組織和正常組織中的表達：A.NKD1；B.β-catenin；C.Cyclin D1

2.3 NKD1、β-catenin、Cyclin D1表達與DLBCL臨床病理特征的關系NKD1、β-catenin、Cyclin D1蛋白在DLBCL不同IPI評分、Ann Arbor分期中的表達差異均有統計學意義(P<0.05)；在不同患者性別、年齡、結構部位的表達差異無統計學意義(P>0.05)。在不同病理分型中NKD1蛋白表達差異有統計學意義(P<0.05)，而β-catenin和Cyclin D1蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05，表2)。

表2 彌漫大B細胞淋巴瘤中NKD1、β-catenin、Cyclin D1表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.4 DLBCL組織中NKD1、β-catenin、Cyclin D1表達的相關性Spearman相關性分析顯示，DLBCL組織中，Cyclin D1和β-catenin的表達呈明顯正相關(r=0.656，P<0.01)，NKD1和β-catenin與Cyclin D1的表達均呈明顯負相關(r=-0.562，r=-0.536，P均<0.01，圖4)。

圖4 彌漫大B細胞淋巴瘤組織中NKD1、β-catenin、Cyclin D1表達的相關性分析：A.NKD1和β-catenin；B.NKD1和Cyclin D1；C.β-catenin和Cyclin D1

*P<0.05

2.5 NKD1、β-catenin、Cyclin D1表達與DLBCL患者生存分析80例DLBCL患者隨訪3年，死亡18例，3年生存率為77.50%(62/80)。DLBCL組織中NKD1陽性患者的3年生存率高于陰性者，差異有統計學意義(P<0.05)，而β-catenin和Cyclin D1陽性患者的3年生存率低于陰性者，但差異無統計學意義(P>0.05，圖5)。

圖5 NKD1、β-catenin、Cyclin D1表達與彌漫大B細胞淋巴瘤患者生存分析：A.NKD1；B.β-catenin；C.Cyclin D1

2.6 Cox多因素回歸分析DLBCL患者的預后采用Cox回歸分析臨床病理因素、NKD1、β-catenin與Cyclin D1表達對DLBCL臨床預后的影響。結果顯示：患者性別、年齡、病理分型、結構部位與DLBCL患者的OS無相關性(P>0.05)；IPI評分(>2分)、Ann Arbor分期(Ⅲ+Ⅳ期)及β-catenin、Cyclin D1蛋白陽性是影響DLBCL預后的風險因素(P<0.05)，NKD1蛋白陽性是保護因素(表3)。

表3 Cox多因素回歸分析彌漫大B細胞淋巴瘤患者的預后

3 討論

KD1是Wnt信號通路的負向調節因子，可通過與散亂蛋白家族成員的特定編碼區結合，降低蛋白表達量，從而對Wnt通路的活化起抑制作用[5]。研究發現[6]，在多種正常或良性病變組織中NKD1均陽性。而傅祥煒等[7]通過qRT-PCR法檢測發現，在結直腸癌組織中mNKD1表達量上調。Flanagan等[8]研究結果顯示，NKD1在82.9%的胃癌組織中表達缺失。本組實驗結果顯示，NKD1在DLBCL組織中的表達明顯低于良性病變組織，且在不同病理分型中NKD1表達差異顯著。上述結果提示NKD1參與腫瘤發展過程中信號通路構建的復雜性。Ann Arbor分期、IPI評分是評估DLBCL惡性程度的重要指標，進一步分析顯示DLBCL組織中NKD1表達缺失隨著Ann Arbor分期及IPI評分升高而增加，說明NKD1低表達能夠間接反映DLBCL惡性生物學行為。

β-catenin可通過與細胞膜上的E-cadherin結合，調控癌細胞的侵襲和遷移能力[9]。但由于β-catenin對癌細胞惡性生物學行為的雙重調控作用，目前已作為靶點成為腫瘤治療的研究熱點。β-catenin在T淋巴母細胞淋巴瘤早期已呈異常表達，并且與腫瘤分期和不良預后存在相關性[10]。本實驗發現DLBCL組織中β-catenin的陽性率高于良性病變組織，說明β-catenin可能參與DLBCL的發生、發展。本實驗結果顯示，在DLBCL不同Ann Arbor分期及IPI評分組中β-catenin表達存在明顯差異，提示β-catenin高表達和DLBCL的生物學行為存在關系。

Cyclin D1是Wnt通路下游的重要靶基因，當通路活性的異常改變，β-catenin在胞內聚集，Cyclin D1轉錄便被激活，這是腫瘤發生的重要機制[11]。研究顯示[12]，Cyclin D1在乳腺癌組織中的表達明顯高于其癌旁正常組織，進一步研究顯示，Cyclin D1過表達可促進乳腺癌細胞的增殖和遷移。本實驗結果顯示，Cyclin D1在良性病變組織中表達缺失，而在DLBCL組織中的陽性率為72.5%，且與IPI評分和Ann Arbor分期密切相關，說明Cyclin D1蛋白是DLBCL的相關蛋白。

作為Wnt信號通路相關蛋白，Pearson相關性分析顯示，DLBCL組織中NKD1、β-catenin、Cyclin D1相互之間均具有相關性，其中NKD1、β-catenin間呈正相關，且均與Cyclin D1表達呈負相關。通過進一步生存分析顯示，NKD1、β-catenin、Cyclin D1表達與患者的OS均相關，本實驗采用Cox多因素回歸分析，提示NKD1、β-catenin低表達或Cyclin D1高表達會導致DLBCL患者較差的預后。

綜上，NKD1、β-catenin在DLBCL中低表達，Cyclin D1呈高表達，三者可作為DLBCL患者預后獨立預測因素。此外，NKD1、β-catenin和Cyclin D1與DLBCL的生物學行為有關，有望成為DLBCL治療的潛在靶點。