高效液相色譜串聯質譜法測定普洱茶生茶中116種農藥殘留

◎ 伍旭東，毛靜春，羅正剛，彭 權，譚文涵

（普洱市質量技術監督綜合檢測中心，云南 普洱 665000）

當今世界，經濟全球化、貿易自由化進程日益加快，世界各國對農產品和食品中要求檢測的農藥、獸藥殘留項目越來越多[1]。我國是茶葉生產大國和貿易大國之一，但近幾年來，發達國家規定的茶葉的檢測項目不斷增加，歐盟2020年的新標準中規定了486種農藥項目，日本在2020年的新標準中規定了208種農藥項目。我國最新的國家標準也將茶葉農殘項目檢測增加到了65項，另外，歐盟、德國、日本等國家和地區還對標準中未列出的其他農藥作了相應規定，這就大幅度擴大了茶葉的檢測項目，而目前有關茶葉中農殘的檢測已有報道[2-3]，但茶葉中農藥多殘留檢測，涉及不同極性和溶解度的各類化合物，再加上茶葉基質復雜，含有色素、生物堿等有機物質和鐵、鈣、鋅等無機元素等成分[2]，進一步增加了提取、凈化和檢測的難度。茶葉行業可持續發展的需求及分析儀器的不斷改進，促進了茶葉農藥殘留分析技術的發展，特別是色譜-質譜技術在農藥多殘留中的應用已成為分析化學領域的研究方向和熱點[3-9]。多殘留檢測通常是指檢測多種的農藥殘留，它能夠做到同時對單一樣品中可能存在的百種以上農藥進行檢測。采用多殘留檢測，可以獲得更有效和更準確的農藥監控，同時也是一種節省人力的方法，并可節省樣品制備和儀器運行成本。以往的檢測方法檢測的農藥數量有限，而且只能針對某一類的農藥，即便是有茶葉中多農藥殘留檢測的，也是分別凈化、分別進樣，并且不使用質譜檢測器，無法對陽性樣品確證，無法滿足國外越來越多、越來越嚴格的茶葉檢測項目。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SCIEX ExionLC液相儀、Triple Quad 3500三重四級桿質譜儀（美國AB Sciex公司）；Kinetex Biphenyl C18色譜柱（100 mm×3.0 mm，2.6 μm，美國飛諾美公司）；PV-1型小型漩渦混勻器（德國IKA公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Diret-Q5型超純水機（法國Milipore公司）；AS3120A型超聲清洗儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；M27942B型移液槍（德國Eppendorf公司）；多通道氮吹儀（美國Organomation公司）。

本實驗所用溶液標準物質為混標，見表1，購于天津阿爾塔科技有限公司，各類物質濃度均為10 μg·mL-1。

乙腈（色譜純，美國J.T.Bake試劑公司）；甲酸、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉（色譜純，美國Sigma公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、碳18（C18）、墨化炭黑（GCB）（天津博納艾杰爾科技有限公司）；硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）。

表1 116種農藥的質譜參數表

續表1

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1.2 標準溶液的配制

準確移取1 mL混合標準物質于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，避光4 ℃保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取

（1）方法1。稱取2 g茶葉樣品（精確到0.01 g），至50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，混勻，超聲提取30 min，接著振搖提取30 min，4 200 r·min-1離心5 min，取10 mL上清液至25 mL試管中，45 ℃水浴中氮吹濃縮至2 mL，待凈化。

（2）方法2。稱取2 g茶葉樣品（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入10 mL水，放置30 min。加入10 mL乙腈，振蕩15 min。再加入4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉和1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉，劇烈振蕩1 min，以3 000 r·min-1離心5 min，準確移取上清層（乙腈層）6 mL至15 mL塑料離心管中，待凈化。

1.3.2 樣品凈化

（1）方法1。活化Cleanert-TPT柱，5 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）溶液淋洗1次，棄去流出液，下接50 mL試管，放入試管架上待用；將濃縮提取液移至Cleanert-TPT柱中，2 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）溶液洗滌試管3次，15 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）洗脫；待所有液體收集完畢后，取下試管；45 ℃水浴中氮吹至干；加入1 mL乙腈+0.1%甲酸水（2+8，V/V）定容，超聲波溶解，經0.45 μm微孔濾膜過濾后，供液相色譜串聯質譜儀（LC/MS/MS）分析。

（2）方法2。向待凈化的離心管里加入450 mg PSA、450 mg C18、200 mg GCB、900 mg硫酸鎂，振蕩混勻30 s，以3 000 r·min-1離心5 min，取3 mL上清液于試管中，氮氣緩緩吹干，1 mL乙腈+0.1%甲酸水（2+8，V/V）復溶，過0.45 μm的濾膜，供液相色譜串聯質譜儀（LC/MS/MS）分析。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Kinetex Biphenyl（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；流動相：A相為水（5 m mol·L-1甲酸銨），B相為乙腈（5 mmol·L-1甲酸銨）；流速：0.4 mL·min-1；梯度洗脫程序：0～0.5 min，5%B；0.5～3 min，5%B→60%B；3～7 min，60%B→80%B；7～15 min，80%B→90%B；15～16 min，90%B→95%B；16～17 min，95%B→97%B；17～17.1 min，97%B→5%B；17.1～20 min，5%B。

1.4.2 質譜條件

離子源：ESI源，正離子模式。檢測方式：多反應檢測（MRM）。離子源溫度：300 ℃。噴霧電壓：5 500 V。氣簾氣：30 psi。霧化氣：50 psi。輔助氣：60 psi。碰撞氣：Medium。其他質譜參數見表1。

2 結果與分析

2.1 凈化效果比較

通過SPE法和QuEChERS法凈化后濃縮定容后的樣品溶液，QuEChERS法共提物較多，SPE法得到的樣品溶液是無色透明溶液，QuEChERS法得到的樣品溶液是淺黃色透明溶液。這些現象說明SPE法的凈化液中雜質含量較少。對比分析了SPE和QuEChERS法處理茶葉空白樣品的總離子流圖（TIC），兩種方法的TIC圖總體比較一致，但由于QuEChERS法在處理過程中提取液與試劑接觸時間較短，很多雜質在凈化過程中沒有處理干凈，導致TIC圖基線較高。而在SPE柱在凈化過程中，提取液以較低的流速通過SPE柱，這使得提取液與吸附劑充分接觸，從而能有效去除大量的茶葉中水溶性和脂溶性的雜質（如多酚類、有機酸、咖啡堿和色素等）。

在茶葉樣品中添加116種農藥標準溶液，添加水平0.02～0.1 mg·kg-1，添加靜置30 min后，SPE和QuEChERS兩種凈化方法制備兩個添加樣品，進行平行實驗，結果見表2。由表2可見，對于平均回收率在70%～80%的農藥，SPE法占11%，QuEChERS法占17.2%；平均回收率在80%～100%范圍內的農藥，SPE法占80%，QuEChERS法占63.8%，同時，SPE法和QuEChERS法RSD小于10%的農藥數量分別占95.2%和87%，表明兩種方法的重復性和再現性均良好。

表2 兩種提取方法普洱茶中116種農藥平均回收率和RSD表

對于兩種方法所需的時間和成本進行評估，以完成一個樣品為例，SPE耗時70 min左右，其中以洗脫和旋轉蒸發步驟最為耗時。此外，SPE法還耗費了約45 mL的乙腈和10 mL的甲苯。而QuEChERS只耗時20 min左右，耗費約20 mL的乙腈。相比之下，QuEChERS法的操作更為簡單快捷，且有機溶劑用量少，實驗成本低，在處理大批量樣品時具有明顯的優勢。QuEChERS雖然省時省力，但凈化效果不如SPE，對儀器會造成一定的污染，儀器設備需要經常維護

2.2 濃縮方式的比較

通過116種農藥的添加回收率實驗，對比了旋轉蒸發濃縮和氮吹濃縮對實驗結果的影響，實驗結果見表3。旋轉蒸發濃縮條件：水浴45 ℃；轉速：4 000 r·min-1；真空-220 psi。氮吹濃縮條件：水浴50 ℃；氮氣壓50 psi。

表3 旋轉蒸發和氮吹濃縮效率對比表

從表3可以看出，兩種濃縮方式均可達到回收率在70%～120%和RSD＜15%的要求，在濃縮環節兩種方法得出的實驗結果并無太大差異。單個樣品30 mL洗脫液濃縮時間，旋轉蒸發需要4 min，而氮吹濃縮需要10 min，旋轉蒸發比氮吹濃縮速度快，但氮吹同時可對42個樣品進行濃縮，而旋轉蒸發要逐個濃縮，并且需要有人持續操作設備，濃縮樣品要不斷輪換，樣品多的情況下效率比較低，所以氮吹濃縮在同時處理多樣品的情況下有比較大的優勢。

2.3 線性范圍與檢出限

如表4所示，利用外標法116種農藥進行定量，將116種目標化合物用甲醇配制成系列質量濃度混合標準溶液，在優化的色譜和質譜條件下進行測定，以目標化合物質量濃度為橫坐標（x，μg·L-1）、定量離子對的峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，得到線性方程和相關系數。結果表明，目標化合物在0.004～0.100 μg·L-1范圍內具有良好的線性關系，相關系數均大于0.099 8。在空白樣品中添加116種農藥標準溶液，以S/N=3確定方法的檢出限（LOD），以S/N=10確定方法的定量限（LOQ），結果如表3所示，樣品中116種目標化合物的LOD為0.000 3～0.1 mg·kg-1，LOQ為0.000 9～0.1 mg·kg-1。

表4 116種農藥線性方程、相關系數、檢出限、定量限表

續表4

續表4

續表4

2.4 方法的回收率和精密度

在空白樣品中添加116種農藥進行添加回收率試驗，對方法的回收率及精密度進行考察。在空白基質中添加0.05 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1、0.5 mg·kg-13個水平的混合標準溶液，每個水平進行6次平行試驗，得到的平均回收率和精密度（n=6）。結果表明116種目標化合物的平均回收率為71%～118.8%，相對標準偏差（RSD）為0.5%～9.8%，可以滿足農藥殘留分析的要求。

3 結論

本方法采用液相色譜-串聯質譜法，結合QuEChERS凈化技術，建立了一次前處理，同時可測普洱茶中116種農藥殘留的系列高通量方法，該方法具有提取時間短、溶劑用量少、萃取效率高的特點，提高了檢測速度和檢測通量