HPLC法測定熟肉制品中山梨酸的不確定度評估

◎ 龐皓元

（廣西壯族自治區食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021）

熟肉制品是指以新鮮禽畜肉為原料，經醬鹵、腌制、熏烤、蒸煮和干制等一種或多種熱加工方式熟化成可直接食用的肉類加工制品[1-2]，生活中常見的預包裝食品椒鹽雞翅、黑椒鴨掌、麻辣小魚仔、發酵肉制品類等都屬于熟肉制品，深受廣大消費者的喜愛。由于肉制品含有豐富的脂肪、蛋白質，在加工、儲藏和銷售過程中，都極易受微生物和環境因素的影響，導致產品腐敗變質，失去食用價值，故添加防腐劑是有效延長肉制品產品保質期的有效方式[3-4]。《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）規定[5]，熟肉制品中可添加0.075 g·kg-1的山梨酸及其鉀鹽，以延長熟肉制品的貨架期和保質期。山梨酸具有低毒性，安全性較好，能較好地發揮抑菌作用[4,6]。不確定度是表征合理的賦予被測量值的分散性，與測量結果相聯系的參數[7]。由于測量結果的不確定度由多種原因引起，故不確定度分為A類不確定度和B類不確定度[7-9]。不確定度數值的大小反應了測量結果的準確性。評定不確定度能提高分析檢測質量的需要，也是實現檢測結果互不可缺少的內容[7-9]。本文通過《食品安全國家標準 食品中山梨酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 500.28—2016）第一法液相色譜法測定熟肉制品中山梨酸的不確定度，以期為實驗室質量控制、能力驗證等提供參考[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熟肉制品，中國檢驗檢疫科學院提供的能力驗證樣品；實驗用水均為超純水；甲醇（色譜純），德國Merck公司；山梨酸標準物質（含量99.99%，相對擴展不確定度0.3%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙酸銨（色譜純），德國Merck公司；乙酸鋅、亞鐵氰化鉀（均為分析純），國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Water 2695高效液相色譜儀（配2998PDA檢測器），美國waters公司；S180H超聲波發生器，德國Elma公司；3-30K離心機，德國Sigma公司；Vortexgenie渦旋混勻器，美國Scientific Industries公司；梅特勒XS205DU電子天平，瑞士梅特勒公司。

1.3 方法

采用《食品安全國家標準 食品中山梨酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016）第一法液相色譜法測定肉制品中山梨酸的含量。

1.3.1 標準溶液配制

（1）標準儲備液。精密稱取山梨酸標準物質25.01 mg，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度，作為標準儲備液（濃度1.000 mg·mL-1）。

（2）標準中間液的配制。精密量取標準儲備液5.00 mL，置于50 mL量瓶中，用水定容至刻度，濃度為100.0 μg·mL-1。

（3）標準曲線的配制。精密量取標準中間液0.00 mL、0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL和7.50 mL分別置于10 mL容量瓶中，用水定容，制成標準曲線L1～L7，濃度分別為1.00 μg·mL-1、2.50 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1、25.00 μg·mL-1、50.00 μg·mL-1和75.00 μg·mL-1。

1.3.2 樣品處理

精密稱取樣品粉末置于50 mL比色管中，加3倍蒸餾水攪拌15 min混勻，即為復原樣品。于復原樣品中加水25 mL，渦旋均勻，于50 ℃水浴超聲20 min，冷卻至室溫后加2 mL（92 g·L-1）的亞鐵氰化鉀溶液，再加入2 mL（183 g·L-1）的乙酸鋅溶液渦旋混勻，于8 000 r·min-1離心5 min，將水相轉移至50 mL容量瓶中，于殘渣中加水20 mL，渦旋混勻后超聲5 min，于8 000 r·min-1離心5 min，將水相轉移至同一50 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。取上清液經0.22 μm濾膜過濾，濾液待上機分析，稀釋倍數為50倍。

1.3.3 色譜條件

流動相：甲醇+20 mmol·L-1乙酸銨溶液（5+95)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：230 nm；進樣量：10 μL；色譜柱：ECHWAY太瑋科技JADE-PAK?ODS-AQ色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.4 不確定度來源分析

1.4.1 不確定度模型

熟肉制品中山梨酸含量的計算公式如式（1）：

式中：X為熟肉制品中山梨酸的含量，mg·kg-1；C為樣品中山梨酸的質量濃度，μg·mL-1；V為樣品的定容體積，mL；m為樣品質量，g。

1.4.2 不確定度來源

從測定過程和數學模型分析，熟肉制品中山梨酸測定的測量不確定度來源主要有以下幾個方面：①標準物質純度的不確定度U(標純)。②標準物質稱量引入的不確定度U(標稱)。③標準曲線配制引入的不確定度U(標配)。④標準曲線擬合引入的不確定度U(標曲擬合)。⑤樣品的質量引入的相對不確定度u(樣稱)。⑥樣品定容體積的不確定度分量U（樣品定容）。⑦樣品測量重復性的不確定度分量U(樣品重復)。⑧高效液相色譜儀測得峰面積的不確定度u（儀器）[11-12]。高效液相色譜法測定熟肉制品中山梨酸的不確定度來源見圖1。

圖1 高效液相色譜法測定熟肉制品中山梨酸的不確定度來源圖

2 結果與分析

2.1 標準物質的相對不確定度U(標純)

由標準物質證書中可知，標準含量值為99.99%，標準值的相對不確定度為±0.3%，

2.2 標準物質稱量引入的相對不確定度U(標稱)

標準物質的稱量質量山梨酸為25.00 mg，用梅特勒XSE205DU電子天平（d=0.01 mg），電子天平稱量樣品，在稱量程范圍內，誤差主要有以下兩方面。

（1）天平示值的不確定度。使用的電子天平依據《電子天平計量檢定規程》（JJG 1036—2008）檢定合格[13]，本次使用梅特勒XSE205DU電子天平（d=0.01 mg），e=10×0.01=0.1 mg，最大允許誤差的絕對值為MPEV=0.5e=0.5×0.1=0.05 mg，按均勻分布計算稱量標準質量時由天平的最大允許誤差引起的標準不確定度為：

（2）按單次測量計，則稱量標準物質質量時由天平的最大允許誤差引起的相對不確定度為：

2.3 標準曲線配制引入的相對不確定度U(標配)

由表1可知，標準曲線配制過程共使用了25 mL容量瓶（A級）1個，50 mL容量瓶（A級）1個，10 mL容量瓶（A級）7個，使用了3次5.0 mL移液器（分別移取5.00 mL 2次，2.50 mL 1次），1次10.00 mL移液器（移取7.50 mL），1次200 μL移液器（移取100 μL），1次1.00 mL移液器（移取0.25 mL 1次，0.50 mL1次，1.00 mL1次）。

由使用的器皿因定值引起的標準不確定度及定容溶劑因溫差產生的體積膨脹引起的標準不確定度詳見表1，可知U（標配）為0.059 48。其中，玻璃器皿和移液器體積定值準確性引入的不確定度以及定容溶劑因溫差（實驗室溫度25 ℃）產生的體積膨脹帶來不確定度均服從均勻分布，包含因子

2.4 標準曲線擬合引入的相對不確定度U(標曲擬合)

標準曲線擬合引入的不確定度，根據公式（2）（3）計算：

式中，SR-標準曲線的殘差標準偏差；n1-樣品溶液的測量次數；n2-標準曲線的測量次數；cj-樣品濃度均值；c標j-第j次測量時標準溶液的濃度；-標準溶液理論濃度平均值；A標j-第j次測量標準溶液時所得峰面積；B0標-標準曲線截距；B1標-標準曲線斜率；U（標曲）標-標準曲線擬合引入的標準不確定度；U（標曲）-標準曲線擬合引入的相對不確定度。

標準曲線擬合引入的不確定度，由表2可知U（標曲擬合）為0.009 18。

表1 標準曲線配制引入的不確定度表

2.5 樣品的質量引入的相對不確定度U(樣稱)

稱取2.00 g 樣品10份，結果如表2所示，平均值2.089 3 g。使用的梅特勒XS205DU電子天平（d=0.1 mg），檢定分度值e=10d=1 mg，在本次測量使用的量程范圍內，誤差主要有以下3方面。

（1）天平示值的不確定度。使用的梅特勒XS205DU電子天平（d=0.1 mg），根據檢定證書，當0≤m≤50 g時，天平示值誤差為0.1 mg，按均勻分布，其標準不確定度為

（2）天平稱量重復性的不確定度。根據檢定證書，天平重復性誤差0.2 mg，按均勻分布，其標準不確定度為：

（3）樣品稱量的標準不確定度：

樣品稱量的相對標準不確定度：

2.6 樣品定容體積的不確定度分量U（樣品定容）

定容的不確定度來源于容量瓶允差和溫度效應兩個方面。

表2 標準曲線擬合引入的不確定度表

（1）量瓶允差的不確定度。根據《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006），50 mLA級容量瓶的最大允許差為±0.05 mL，服從三角分布，則有：

（2）溫度效應的不確定度。實驗室溫度（25 ℃）與容量瓶校正時的溫度（20 ℃)不相同引起的體積不確定度，水體積膨脹系數為2.08×10-4mL·℃-1，在95%置信概率下，按矩形分布，屬B類不確定度，因此產生的體積膨脹不確定度照均勻分布計算為；

則樣品溶液定容體積的相對標準不確定度：

2.7 樣品測量重復性的不確定度分量U(樣品重復)

重復10次檢測山梨酸含量，其測定結果如表3所示，10份試樣平均含量為52.678 mg·kg-1，所引起的不確定度，主要考慮A類不確定度。根據JJF 1135—2005的公式（4）～（7）合并計算，公式如（4）所示：

式中：X-單個試樣中山梨酸的含量，單位為mg·kg-1；Xi-試樣中山梨酸的含量平均值，單位為mg·kg-1；n1-樣品溶液的測量次數，本試驗n1=10；n2-單個樣品檢測次數，本試驗n2=2。

由式（4）求得U(樣品重復)=0.004 992 75 mg·kg-1。

2.8 高效液相色譜儀測得峰面積的不確定度U（儀器）

由校準證書上可知，Waters 2695高效液相色譜儀的定量重復性為1.8%，按均勻分布計算，則液相色譜儀的標準不確定度為

2.9 相對合成標準不確定度評定

由于各參數之間相互獨立，各不確定度分量詳細情況見表4，故相對合成標準不確定度：

表3 10份平行試樣峰面積及含量測定結果表

表4 不確定度一覽表

2.10 擴展不確定度

選擇95%置信概率，取包含因子k=2，測量結果不確定度：U=k×U（合成），取k=2，則U=k×U（合成）=2×3.260＝6.519 mg·kg-1。

2.11 結果表示

根據JJF 1135—2005標準規定，擴展不確定度的有效數字不超過2位，本次肉制品中山梨酸的測定平均結果為：52.678 mg·kg-1，測定結果表示為：X=（52.678±6.519）mg·kg-1，k=2。

3 結論

在高效液相色譜法測量熟肉制品中山梨酸含量的實驗時，對熟肉制品重復測定10次，平均含量為52.678 mg·kg-1，其擴展不確定度為6.519 mg·kg-1。熟肉制品中山梨酸測定結果的不確定度主要來源于標準溶液配制引入的B類不確定度和儀器定量重復性引入的A類不確定度。在實際操作中，應盡量減小這兩部分的影響，有效降低結果的擴展不確定度。