分散固相萃取-超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜測定櫻桃中的苯丁錫和三苯錫的方法研究

◎ 陳佩佩，陳琳珊，何雯倩，陳 茹

（1.廣東省食品工業公共實驗室，廣東 廣州 511442;2.廣東省食品工業研究所有限公司，廣東 廣州 511442;3.廣東省質量監督食品檢驗站，廣東 廣州 511442）

苯丁錫和三苯錫是一類感溫型抑制神經組織的有機錫殺螨劑，化學結構見圖1，其特點為高效、毒性低、效果持續時間長，對防治果樹、茶樹、柑橘、葡萄和櫻桃等作物蟲害有顯著效果，因此，近年來在農作物中應用廣泛，同時在木材防腐方面也有較大的作用[1-2]。目前，對于苯丁錫和三苯錫的相關毒理性研究尚不充分，有研究表明，苯丁錫和三苯基錫具有一定的毒性，對牡蠣和其他貝類的生長有一定的影響[3]，而三苯基錫毒性比較大，低濃度就能引發生物體的內分泌紊亂[4]。因此，對消費者也產生了一定的潛在風險。美國、日本、歐盟等國家也制定了相關的限量標準。GB 2763—2019中明確規定，苯丁錫在柑橘中的限量為1 mg·kg-1，而在蘋果、梨、葡萄等水果中，限量為5 mg·kg-1，櫻桃、香蕉、草莓則是10 mg·kg-1，同時也增加了動物肉類的限量[5]。因此，建立高效快捷的測定方法具有重要的意義。

近年來，研究者對有機錫的測定方法進行了大量的研究。目前檢測有機錫的方法主要有高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法[6-7]、氣相色譜法[8]、氣相色譜-串聯質譜法[9-10]、高效液相色譜法[11-12]和高效液相色譜-串聯質譜法[13]。高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法操作煩瑣，所需試劑多，氣相色譜及質譜法需對樣品進行衍生，同樣操作煩瑣，且重復性差，液相色譜法則存在靈敏度低，目標物受雜質干擾嚴重等缺點。本文建立了分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定櫻桃中的苯丁錫和三苯錫，前處理簡單高效，且峰型好，靈敏度高，分析時間短，可進行日常實驗室大批量的測定。

圖1 苯丁錫和三苯錫的化學結構圖

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

API4000Q質譜儀（美國AB SCIEX公司）；島津LC-20AD液相色譜系統（日本島津公司）；Milli-Q Advantage A10超純水系統（法國Merck Millipore公司）；4k-15離心機（北京卓明貿易有限公司）；IKA Vortex4渦旋混勻器（廣州儀科實驗室技術有限公司）。

1.2 試劑及耗材

櫻桃樣品購自廣州市市場；苯丁錫和三苯錫（純度≥98.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；無水硫酸鎂和氯化鈉（分析純，廣州化學試劑廠）；甲酸、乙腈（HPLC級，美國Thermo Fisher公司）；C18、PSA、GCB、NH2粉和中性氧化鋁（分析純，上海安譜公司）；實驗用水為經Milli-Q凈化系統過濾的超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm-1）。

1.3 樣品前處理

櫻桃樣品均質后稱取2 g樣品于50 mL離心管中，加入5 mL 水和10 mL乙腈，渦旋混勻后加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉粉末，渦旋提取10 min后，置于離心機中以10 000 r·min-1離心5 min-1，轉移上清液1 mL至2 mL離心管中，加入30 mg C18粉末，渦旋2 min，10 000 r·min-1離心5 min，上清液過0.22 μm有機相濾膜上機。

1.4 標準溶液的配制

分別準確稱取適量的苯丁錫和三苯錫標準品于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，再分別吸取一定量體積的標準溶液于同一10 mL容量瓶中，用乙腈定容，折算后混合標準溶液濃度均為10 mg·L-1。

取陰性櫻桃樣品進行前處理，得到空白基質液，用所得基質液配制基質曲線，濃度分別為5.0 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1和500 μg·L-1。

1.5 色譜及質譜條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：Xbridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流 動 相A（甲 醇）-B（0.3%甲 酸 含10 mmol·L-1甲酸銨）；流速：0.30 mL·min-1；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；梯度洗脫程序：0.0～2.0 min，40%→95%A；2.0～8.0 min，95%A；8.0～9.0 min，95%→40%A；9.0～13.0 min，40%A。

1.5.2 質譜條件

離子源：電噴霧電離源；掃描方式：正離子模式；氣簾氣：25 psi；電離電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；霧化氣（GAS1）：50 psi；加熱輔助氣（GAS2）：50 psi；碰撞氣（CAD）：medium；采集模式：多反應監測（MRM）模式。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

實驗嘗試使用乙腈和甲醇作為有機相，0.3%甲酸溶液和0.3%甲酸含10 mmol·L-1甲酸銨溶液作為水相進行了對比。結果發現，甲酸銨的加入對峰型影響較大，當水相中沒有甲酸銨作為緩沖鹽時，苯丁錫在流動相中擴散嚴重，峰型影響尤其明顯，峰寬較寬，拖尾嚴重。而乙腈和甲醇相比，峰型影響不是很大，苯丁錫和三苯錫均能有較好的峰型，但考慮到乙腈洗脫能力較強，可能造成的基質效應相比甲醇更嚴重，所以綜合考慮，選擇甲醇-0.3%甲酸含10 mmol·L-1甲酸銨體系作為流動相。苯丁錫和三苯錫的MRM色譜圖見圖2。

圖2 苯丁錫與三苯錫的MRM色譜圖

2.2 質譜條件的確定

實驗初期發現，苯丁錫和三苯錫的母離子均是由O-Sn鍵斷裂，產生對應的脫電子正離子，同時因為Sn的同位素較多，所以得到的母離子也較多，最終選擇響應較高的作為母離子。進一步采用流動注射方式，優化去簇電壓DP，使母離子響應達到最優，確定DP后，進一步優化各碎片離子的碰撞電壓CE，選擇響應較高的兩個離子對作為定性定量依據，響應最高的為定量離子，另外的為定性離子。詳細的質譜參數見表1，質譜圖見圖3。

表1 多反應監測測定二級碎片的質譜參數表

圖3 苯丁錫和三苯錫的二級質譜圖

2.3 固相萃取劑種類的選擇

為了降低基質效應對結果的影響，同時保證回收率，實驗前期對固相萃取劑的種類對回收率的影響進行了探究，選取了C18、PSA、GCB、NH2和中性氧化鋁作為固相萃取劑，使用量均為25 mg。結果顯示，在兩次平行實驗中，C18和PSA的回收率最高，其次是NH2，對苯丁錫和三苯錫的吸附也相對較小。而GCB和中性氧化鋁對苯丁錫和三苯錫吸附嚴重，導致回收率低。雖然C18和PSA吸附的雜質類型不同，但由于兩者回收率均較高，且C18的回收率要略高于PSA，因此為了簡化實驗，最終選擇只使用C18作為固相萃取劑。回收率結果見圖4。

圖4 固相萃取劑對回收率的影響圖

2.4 基質效應的探討

櫻桃中含有大量的糖和色素，在提取過程中易被提取到乙腈層引起較大的基質效應，從而增強或抑制苯丁錫和三苯錫的離子化程度，因此，需要對基質效應進行研究和定量結果校正。實驗分別用乙腈和空白基質液配制100 μg·L-1的單點混合標準溶液，按優化后的方法測定，以基質單點和溶劑單點的峰面積比值K為判斷依據。當K值小于80%，則說明基質抑制效應明顯，大于120%則說明基質增強效應明顯。測定結果為苯丁錫38.5%，三苯錫39.8%，基質抑制效應較為嚴重，因此，最終使用基質曲線進行定量。

2.5 定量分析依據

用空白基質溶液配制線性范圍為5.0～500 μg·L-1的基質曲線對苯丁錫和三苯錫進行定量。將基質曲線按前處理方法上機測定后，以濃度為橫坐標（X）和定量離子對峰面積為縱坐標（Y）繪圖，所得方程為苯丁錫：Y=38.86X+2 304，相關系數R2為0.999 1；三苯錫：Y=40.21X+2 553，相關系數R2為0.999 2。結果表明苯丁錫和三苯錫的基質曲線在5.0～500 μg·L-1的濃度范圍內呈良好線性關系。同時以低濃度加標進行測定，按照信噪比RS/N=3和RS/N=10分別計算出方法檢出限和方法定量限，苯丁錫和三苯錫的檢出限均為25 μg·kg-1，定量限均為100 μg·kg-1，方法靈敏度達到分析測定要求，滿足樣品一般含量的測定。

2.6 回收試驗及精密度

選用苯丁錫和三苯錫呈陰性的櫻桃樣品，進行加標回收實驗。根據方法定量限的1、2、5倍進行標準添加，每個水平平行測定6次，并計算出相應的相對標準偏差RSD。結果得出，苯丁錫和三苯錫在櫻桃中的平均回收率范圍在80.7%～94.5%，RSD在1.26%～4.52%。表明方法回收率好，精密度高，能夠準確定量櫻桃中的苯丁錫和三苯錫含量，具體結果見表2。

表2 櫻桃中苯丁錫和三苯錫的回收率和精密度（n=6）表

2.7 方法的實際應用測定

隨機選取實驗室日常樣品30個，用建立的方法進行測定，測定結果為三苯錫均低于檢出限，而有一個樣品檢出了苯丁錫，含量為1.51 mg·kg-1，高于定限量，但符合GB 2763—2019中櫻桃樣品苯丁錫的檢出限量10 mg·kg-1規定。同時，說明目前市面上的櫻桃存在一定的苯丁錫殘留風險，需要加大監管力度。

3 結論

本研究以分散固相萃取為前處理基礎，建立了超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定櫻桃中的苯丁錫和三苯錫。乙腈-水體系提取，過程快速高效，提取率高，結合C18固相萃取劑進行凈化，回收率高；使用超高效液相色譜柱，梯度洗脫分離，在優化后的流動相和洗脫程序下，苯丁錫和三苯錫在9 min內出峰，且拖尾現象不嚴重，峰型較好；利用基質曲線對定量結果進行校正，加標回收實驗結果表明，方法回收率好、重現性好，可用于實際測定櫻桃中的苯丁錫和三苯錫。