木犀草素銅配合物的抗氧化活性與配位模式研究

臧昕 王家文 周坤鵬 厲詩嫻 林瑋 李婧

摘 要：黃酮類金屬配合物具有多種生物和藥理活性。通過木犀草素及其銅配合物與DPPH·、·OH、O2·-作用，探討木犀草素及其銅配合物的抗氧化活性。結果顯示，銅配合物較木犀草素對·OH的清除能力減弱較為明顯，對DPPH·、O2·-的清除能力下降不明顯。這進一步驗證了木犀草素以4-C=O和5-OH與銅離子配位，配位模式與抗氧化活性密切相關。

關鍵詞：木犀草素;銅配合物;抗氧化活性;配位模式

中圖分類號 O657.3;R285.5文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）10-0018-03

Study of Antioxidant Activity and Coordination Mode of Luteolin Copper Complex

ZANG Xin et al.

（Heilongjiang Bayi Agricultural University， College of Life Science and Biotechnology， Daqing 163319，China）

Abstract： Flavonoid metal complexes have many biological and pharmacological activities. In this research， luteolin and its copper coordination complex were studied antioxidant activity by examining the free radical scavenging effects through reactions with DPPH·， ·OH and O2·-. The results showed that radical scavenging ability of luteolin copper complex on ·OH was weakened obviously compared with luteolin， while the activities on DPPH· and O2·- were slightly lower than that of luteolin. The experiments confirm that luteolin is coordinated with copper ion via 4-C=O and 5-OH， the coordination mode is highly related to the antioxidant activity.

Key words： Luteolin; Copper complex; Antioxidant activity; Coordination mode

木犀草素（luteolin）是具有C6-C3-C6結構的典型黃酮類化合物，多存在于木犀草、金銀花、菊花、荊芥等草本植物中，不僅具備抑制腫瘤生長、減少激素分泌、抗菌、抗過敏、抗病毒的生物活性，也可顯著抑制TNF-α（腫瘤壞死因子）和IL-6（白細胞介素），同時促進炎癥細胞中Nrf2的表達，使氧化應激狀態維持較低水平，從而發揮抗氧化作用[1-3]。由于木犀草素的3′、4′、5和7位上均含有羥基，因此將其作為配體與金屬離子絡合形成配合物，所得配合物在裂解DNA、殺滅癌細胞、清除自由基等生物活性方面均有一定的改善作用[4]。 木犀草素可以與Fe3+、Mn2+、Cr3+、Zn2+、Ca2+等多種金屬元素進行配合[5-6]，木犀草素中4-C=O和5-OH、3′-OH和4′-OH可以分別與金屬離子配位形成配合物。關于配位化合物結構的分析，目前多從紅外、紫外、元素分析等表征中推斷木犀草素與金屬離子的配位形式。為此，筆者應用木犀草素與新戊酸銅或苯甲酸銅制備木犀草素銅配合物，分析論證配合物的結構（圖1）[7]。為研究木犀草素銅配合物的抗氧化能力及其與配位模式的關系，應用木犀草素及其銅配合物與DPPH·、

·OH、O2·-等3種自由基在不同濃度下相互作用，通過紫外可見光譜分析對自由基的清除效果，對比抗氧化能力，結合木犀草素羥基對自由基的活性能力，闡明抗氧化能力與配位模式的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 木犀草素（上海賢鼎公司），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·，上海阿拉丁試劑），30%H2O2（麥克林公司），其他試劑、藥品均為分析純。

1.2 試驗方法 紫外吸收光譜由Thermo Fisher Scientific分光光度計測得;紅外光譜在Nicolet 380型紅外光譜儀上通過KBr壓片法測得;元素分析在Vario Micro cube上測得。參照課題組前期文獻[7]，將4mmol的木犀草素完全溶解于5mL無水乙醇中，滴加2mmol新戊酸銅的乙醇（5mL）溶液，充分混合并于85℃恒溫水浴中回流反應75min，過濾后自然晾干，得到黑色固體，即木犀草素銅配合物。

1.3 自由基清除率測定

1.3.1 DPPH· 稱取0.0039g DPPH·固體，于1mL無水乙醇中充分溶解，從中取0.1mL加入到19.9mL無水乙醇中混勻，制得0.5μmol/mL DPPH·溶液，避光保存;稱取0.0014g木犀草素粉末，加入20mL無水乙醇混合均勻，制成0.5μmol/mL淡黃色溶液;稱取0.0064g銅配合物，以20mL DMSO為溶劑制成0.5μmol/mL橙黃色溶液。將上述溶液均按梯度稀釋為2.5×10-1、1.25×10-1、6.25×10-2、3.13×10-2、1.56×10-2、7.81×10-3、3.91×10-3、1.95×10-3和9.77×10-4μmol/mL共10個濃度。在EP管中加入1mL DPPH·溶液，再加入1mL樣品溶液，震蕩均勻后于室溫條件下避光反應35min，隨后取出，以無水乙醇為背景，在517nm處測其紫外吸光度A1;將樣品溶液替換為樣液所用溶劑，重復上述反應，記錄紫外吸光度A0;將DPPH·替換為無水乙醇，仍加入1mL樣品溶液，重復上述反應，并記錄紫外吸光度A2，以除去計算時樣品溶劑的影響。

DPPH·清除率（%）=[A0-（A1-A2）]/A0×100

1.3.2 ·OH 稱取0.0139g的FeSO4·7H2O，加蒸餾水定容至50mL，制成1μmol/mL FeSO4溶液;取3.3mL30% H2O2溶液，加蒸餾水定容至50mL，制成2μmol/mL H2 O2溶液;取0.0116g的水楊酸固體粉末，加入14mL無水乙醇混勻，制成6μmol/mL水楊酸溶液;木犀草素、配合物按照上述配置并稀釋。在EP管中加入1mL FeSO4溶液和1mL H2O2溶液，再加入2mL樣品溶液，混合均勻，于37℃恒溫水浴中反應20min，取出，再加入1mL水楊酸，震蕩均勻，繼續水浴反應20min，以蒸餾水為背景，在520nm處測其紫外吸光度A1;將樣品溶液替換為溶劑，重復上述反應，記錄紫外吸光度A0。

·OH清除率（%）=（A1-A0）/A0×100

1.3.3 超氧陰離子（O2·-） 稱取0.6057g Tris-base固體，加蒸餾水定容至50mL，制成0.1mmol/mL Tris溶液;稱取0.0063g鄰苯三酚固體，用0.01mmol/mL HCl溶液溶解，并定容至100mL，制成0.5μmol/mL鄰苯三酚溶液;木犀草素、配合物按照上述配置并稀釋。在EP管中加入1mL鄰苯三酚溶液，再加入0.4mL Tris溶液，混勻后靜置1.5min，加入1mL 樣品溶液，震蕩均勻，反應5min后加入0.25mL HCl溶液終止反應，記錄吸光度A1;將樣品溶液替換為溶劑，重復上述反應，記錄紫外吸光度A0。

O2·-清除率（%）=（A1-A0）/A0×100

2 結果與分析

2.1 對DPPH·自由基的清除作用 在對DPPH·清除機理的研究中，黃酮化合物通過HAT機理進行反應。DPPH·的無水乙醇溶液呈深紫色，隨著反應的進行，其含有孤電子的2-N奪取木犀草素羥基上的氫原子，破壞共軛結構，使得溶液逐漸轉變為淡黃色，其中木犀草素的羥基對自由基的活性順序為4′-OH>3′-OH>5-OH>7-OH，4′-OH的活性最強[8]。木犀草素及其配合物對DPPH·的清除能力如圖2所示。由圖2可知，隨著樣品濃度增大，清除率增大。在濃度為9.8×10-4μmol/mL和1.95×10-3μmol/mL時，其對DPPH·的清除率均在10%以下;隨著濃度增長至5×10-1μmol/mL，清除率達到最高，分別為89.43%和83.61%;配合物的清除能力整體上較木犀草素有小幅降低。這表明銅離子發生配位后，3′-OH、4′-OH不能參與配位，這2個羥基與自由基反應能力較強，若它們參與了銅離子的絡合，清除率將會出現較大程度的下降;同時也表明銅配位后不利于斷裂O-H鍵與半醌式自由基形成穩定結構，從而導致清除能力的略微下降。由此可見，配合物結構中4-C=O和5-OH參與配位，3′-OH、4′-OH未參與配位。

2.2 對·OH的清除作用 FeSO4溶液與H2O2混合后產生·OH，隨著反應的進行，游離的·OH與配合物結合，溶液逐漸變為深棕色，接著在此溶液中加入水楊酸，與剩余的·OH相互作用，產生2，3-羥基苯甲酸，使得溶液呈淺紫色[9]。木犀草素及其銅配合物對·OH的清除作用如圖3所示。由圖3可知，樣品溶液濃度為9.8×10-4μmol/mL時，沒有清除能力;之后隨著濃度的提升，木犀草素及其銅配合物對羥基自由基的清除率不斷增大，但配合物的清除作用增長相對緩慢;木犀草素自2.5×10-1μmol/mL后可完全清除自由基，而配合物在5×10-1μmol/mL時清除效果僅有61.5%。由此可見，配合物對·OH的清除作用較木犀草素降低較多，這可能是由于配位后Cu2+的存在使配合物中羥基提供氫離子的能力下降，從而導致其清除羥基自由基的能力減弱。

2.3 對超氧陰離子（O2·-）的清除作用 鄰苯三酚溶液中加入Tris溶液，即溶液由弱酸性變為弱堿性后，發生自氧化產生O2·-，且溶液逐漸變為黃棕色，在加入樣品溶液后，隨著反應的進行，配合物與超氧陰離子結合，同時溶液轉變為棕色[10]。在對超氧陰離子的淬滅能力中，黃酮類各環上的羥基活性相差較大[11]：B環上含有的酚羥基活性最高;A環上含有酚羥基活性最弱;若C環上不飽和雙鍵鏈有羥基，則C環也具有較強的抗氧化活性。木犀草素C環上不含有羥基，因此淬滅能力只由B環和A環上羥基決定完成。由圖4可知，木犀草素及其銅配合物對超氧陰離子的淬滅能力相當。當濃度為9.8×10-4μmol/mL時，兩者均沒有清除效果;隨著濃度的增大，兩者對超氧陰離子自由基的清除率逐漸升高，當濃度為1.25×10-1μmol/mL時，木犀草素及其銅配合物清除率分別達到95.41%和97%，且兩者均可在5×10-1μmol/mL的濃度下完全清除O2·-。由此可見，配合物的清除能力基本不受Cu2+的影響，這也證實配合物中Cu2+的配位位點為4-C=O和5-OH，而3′-OH和4′-OH未參與配位。

3 結論與討論

試驗結果顯示，對DPPH·的清除中，木犀草素銅配合物能力輕微降低;對·OH的清除中，配合物的能力下降較大;對O2·-的清除中，兩者能力相當。對比3種自由基化合物，超氧自由基氧化能力較強，反應較快，黃酮上羥基所具有的不同活性能決定物質的抗氧化能力;·OH氧化能力稍弱，反應較慢，但其位阻較小，木犀草素分子內羥基位置影響較小，但羥基的個數及分子的還原態對·OH的影響較大;DPPH·的氧化能力也稍弱，分子結構較大，位阻較·OH大，在奪取黃酮上自由基的過程中，活性較強的羥基位點對DPPH·的清除起著重要作用。結合抗氧化能力與分子結構分析，本研究進一步證明木犀草素4-C=O和5-OH與銅離子配位，也為黃酮類化合物金屬配合物的抗氧化活性研究及對配位結構研究提供了參考。

參考文獻

[1]Lin Yong，Shi Ranxin，Wang Xia，et al. Luteolin， a flavonoid with potential for cancer prevention and therapy[J]. Current Cancer Drug Targets，2008，8（7）：634-646.

[2]孫霽寒，王兆丹，孫桂菊，等.木犀草素對高血脂癥SD大鼠肝臟脂肪變性及抗氧化水平的影響[J].食品工業科技，2019，40（11）：308-312，317.

[3]王偉，何平，江小明.木犀草素及其黃酮苷的抗炎、抗氧化作用[J].食品科學，2020，41（17）：208-215.

[4]李海霞，郭芳.黃酮類化合物金屬配合物研究進展[J].中國藥房，2016，27（34）：4872-4876.

[5]蔡勝.木犀草素和金屬配合物的制備及其生物活性研究[D].廣州：華南理工大學，2016.

[6]熊運浩.基于中藥配位化學學說的四種木犀草素金屬配合物的合成、結構表征及活性研究[D].南昌：江西科技師范大學，2018.

[7]臧昕，王家文，林悅，等.木犀草素銅配合物的制備及其對DNA的裂解作用研究[J].山東化工，2020，49（18）：14-16.

[8]夏小明，張杰，劉繡華.木犀草素-錫（Ⅱ）配合物的合成、表征及抗氧化活性研究[J].天然產物研究與開發，2013，25（05）：656-661.

[9]吳春，黃梅桂，車春波.槲皮素-鋅（Ⅱ）配合物清除自由基的活性研究[J].食品工業科技，2010，31（01）：128-129，247.

[10]袁倬斌，高若梅.鄰苯三酚自氧化反應的動力學研究[J].高等學校化學學報，1997（09）：1438.

[11]趙靜，李玉琴，王芳喬，等.6種黃酮類化合物清除超氧陰離子自由基能力及其構效關系[J].中國醫藥導報，2014，11（29）：7-10，14.

（責編：徐世紅）