葒草提取物對大鼠CYP450酶的抑制作用評價

呂婷 潘潔 陸苑 孫佳 劉春花 李勇軍 王永林

摘要 [目的]考察葒草提取物對大鼠肝微粒體CYP450中6種亞型酶的體外抑制作用，從而預測發生藥物相互作用的可能性，為臨床合理用藥提供科學依據。[方法]在肝微粒體孵育體系中，將葒草提取物分別與混合探針底物（非那西丁/CYP1A2、氯唑沙宗/CYP2E1、右美沙芬/CYP2D4、奧美拉唑/CYP2C19、甲苯磺丁脲/CYP2C11、睪酮/CYP3A2）共同孵育，UPLC-MS/MS 檢測各探針底物的代謝物生成量，采用GraphPad v5.0 軟件計算半數抑制濃度（IC50）。[結果]葒草提取物對大鼠肝微粒體中 CYP1A2、CYP2E1、CYP2D4、CYP2C19、CYP2C11 和CYP3A2的IC50值在85.75～345.00 μg/mL。[結論]在臨床劑量下，葒草提取物對大鼠肝微粒體CYP2C19、CYP2D4有弱抑制作用，對CYP1A2有強抑制作用。

關鍵詞 葒草提取物;細胞色素P450酶;抑制作用;藥物相互作用

中圖分類號 R285.5文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2021）02-0162-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.044

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Evaluation of the Inhibitory Effect of Polygonum orientale L. Extract on CYP450 Enzymes in Rats

L Ting1，2， PAN Jie1， LU Yuan1 et al

（1.State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants， Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics， Guizhou Medical University， Guiyang， Guizhou 550004;2. School of Pharmacy，Guizhou Medical University， Guiyang， Guizhou 550004）

Abstract [Objective]To investigate in vitro inhibition effect of Polygonum orientale extract on six subtypes of enzyme in rat liver microsomal CYP450， to predict the possibility of drug interactions， and provide scientific basis for clinical rational drug use. [Method]In the liver microsome incubation system， the Polygonum orientale extract was mixed with the probe substrates （phenacetin/CYP1A2， chlorzoxazone/CYP2E1， dextromethorphan/CYP2D4， omeprazole/CYP2C19， tolbutamide/CYP2C11， testosterone/CYP3A2） were incubated together.The quantitation of metabolites of substrates was achieved by UPLCMS/MS，the IC50 values were calculated by GraphPad v5. 0 software.[Result]The IC50 values of Polygonum orientale extract on CYP1A2，CYP2E1，CYP2D4，CYP2C19，CYP2C11 and CYP3A2 of rat liver microsomes were in the range of 85.75-345.00 μg/mL. [Conclusion] In clinical doses， Polygonum orientale extract have weak inhibitory effect on rat liver microsomal CYP 2C19 and CYP 2D4， have strong inhibition on CYP1A2.

Key words Polygonum orientale L. extract;Cytochrome P450 enzymes;Inhibition;Drug interaction

葒草為蓼科植物葒草（Polygonum orientale L.）的干燥果穗及帶葉莖枝，在貴州省分布廣泛，在該省民間常用于胸痛、胸悶、氣短、中風偏癱（嘴角歪斜）等疾病的治療[1]，具有潛在的藥用開發價值。許多學者對葒草藥材的藥用部位篩選[2]、化學成分[3-5]、指紋圖譜[6]、質量標準[7]、提取工藝[8]等關鍵技術進行了研究。目前已研制開發了2個中藥新藥：注射液復方葒草凍干粉針[9]、葒葉心通軟膠囊[10]，用于治療冠心病與心絞痛。

該試驗采用Cocktail探針藥物法，選擇較為典型的6種探針藥物（非那西丁、奧美拉唑、甲苯磺丁脲、右美沙芬、氯唑沙宗、睪酮分別作為CYP1A2、CYP2C11、CYP2C19、CYP2D4、CYP2E1、CYP3A2）所對應的特異性底物[11-12]，測定葒草提取物對大鼠肝微粒體中CP450酶活性的影響，預測與其他藥物聯合應用是否存在潛在的代謝性藥物相互作用，為葒草臨床合理用藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器。

ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S超高效液相色譜-三重四級桿質譜串聯儀（美國Waters）;Varioskan Lux 多功能酶標儀（美國ThermoFisher）;Beckman Coulter Optima XPN-100智能型超速離心機（美國Beckman）;Forma 905-ULTS1490 醫用低溫冰箱（美國Thermo Fisher）;ST40R 臺式大容量冷凍離心機（美國ThermoFisher）;Allegra64R臺式冷凍離心機（美國Beckman）;IMS-70雪花制冰機（普瑞賽斯儀器）;DK-8D電熱恒溫水槽（普瑞賽斯儀器）;KQ-300DE超聲波清洗器（貴州中潤四通科技有限公司）;VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器（藤錦（北京）醫藥科技有限公司）;XYN-15LP氮吹儀氮氣發生器（上海析友分析儀器有限公司）。

1.1.2 試藥。

葒草藥材，購自貴州省盤州市，由貴州醫科大學藥學院藥用植物學與生藥學教研室劉春花副教授鑒定;右美沙芬，批號為090M1298V，購于美國 Sigma 公司;奧美拉唑、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗，批號分別為J0508A、J1010A、J1115A，購于美倫生物;睪酮，批號L31J8T40939，購于源葉生物;對乙酰氨基酚，批號為B14A9E58584，購于源葉生物;右啡烷，批號JC0496-201706111，購于上海健超生物科技有限公司;羥基甲苯磺丁脲（批號S002875）、5-羥基奧美拉唑（批號FS1607320）、6-羥基氯唑沙宗（批號FS16070322）和 6β-羥基睪酮（批號ALT701407），購于美國A ChemTek公司;NADPH，批號704S022，購于美國索萊寶;乙腈購于德國默克試劑公司;其他無機鹽均為分析純;甲醇為色譜純。

1.1.3 實驗動物。

SD大鼠，雄性，180～220 g，SPF級，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供（動物許可證號SCXK（渝）2012-0008）。

1.2 方法

1.2.1 葒草提取物的制備。

取葒草藥材10 kg，分別用10倍水煮3次，每次1 h，過濾，合并濾液，濾液濃縮至1 g/mL;緩慢加入乙醇使溶液含醇量達65%，繼續攪拌30 min，靜置12 h，抽濾，濾液濃縮至1 g/mL;以1/2倍水飽和正丁醇萃取4次，合并正丁醇相，減壓回收正丁醇;正丁醇提取物加80%乙醇溶解，上聚酰胺柱，用8倍柱體積的80%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，殘留物微波真空干燥，得葒草提取物，收膏率為5.02%。

1.2.2 大鼠肝微粒體的制備。

大鼠禁食一夜，股動脈取血處死。取肝臟，生理鹽水灌注至土黃色，1.15% KCl溶液洗滌3次，濾紙吸干稱重。剪碎，加3倍體積的EDTA勻漿液，冰浴中勻漿。4 ℃，1 072 r/min離心10 min，取上清，紗布過濾取上清;4 ℃，4 290 r/min離心20 min，紗布過濾取上清;4 ℃，35 320 r/min離心45 min，棄上清。沉淀加入20%甘油重懸液，吹散均勻，BCA試劑盒測定蛋白濃度，分裝，-20 ℃下預存60 min，轉移至-80 ℃保存。

1.2.3 溶液的配制。

1.2.3.1 混合探針的配制。

分別精密稱取非那西丁、奧美拉唑、甲苯磺丁脲、右美沙芬、氯唑沙宗和睪酮約10 mg，甲醇定容至10 mL，得濃度依次為1.070、1.033、1.043、1.042、1.004、1.049 mg/mL，作為儲備液。臨用前，精密吸取非那西丁貯備液24 μL、奧美拉唑貯備液12 μL、甲苯磺丁脲貯備液396 μL、右美沙芬貯備液18 μL、氯唑沙宗貯備液385 μL和睪酮貯備液21 μL于10 mL EP管中，氮氣吹干，加入30 μL DMSO溶解混合底物，然后用 PBS 緩沖溶液（pH 7.4）定容至6 mL，37 ℃ 預熱待用。此時，非那西丁、奧美拉唑、甲苯磺丁脲、右美沙芬、氯唑沙宗和睪酮的濃度分別為 10.0、2.5、100.0、5.0、150.0、5.0 μmol/L。

1.2.3.2 探針代謝物對照品溶液的配制。

稱取適量對乙酰氨基酚、5-羥基奧美拉唑、羥基甲苯磺丁脲、右啡烷、6-羥基氯唑沙宗和6β-羥基睪酮分別溶于甲醇，所得濃度分別為100.2、100.0、98.8、100.0、101.4、102.9 μg/mL，作為儲備液。

1.2.3.3 特異性抑制劑的配制。

精密稱取適量α-萘黃酮、噻氯匹定、氟康唑、奎尼丁、氯美噻唑和酮康唑，加入適量甲醇，超聲3 min，放冷至室溫，再定容得濃度分別為1.023mg/mL（α-萘黃酮）、1.079 mg/mL（噻氯匹定）、1.099 mg/mL（氟康唑）、1.021 mg/mL（奎尼丁）、1.452 mg/mL（氯美噻唑）、1.005 mg/mL（酮康唑）的儲備液，-20 ℃下儲存，臨用前用PBS緩沖液稀釋至所需濃度。

1.2.4 孵育體系與樣品前處理。

將50 μL肝微粒體蛋白（終濃度為1 mg/mL）、50 μL 葒草提取物/特異性抑制劑（用PBS稀釋至不同濃度）、80 μL混合探針藥物（CYP1A2、CYP2C11、CYP2C19、CYP2D4、CYP2E1、CYP3A2的底物非那西丁、奧美拉唑、甲苯磺丁脲、右美沙芬、氯唑沙宗、睪酮終濃度分別為10.0、2.5、100.0、5.0、150.0、5.0 μmol/mL）在37 ℃下水浴預孵育5 min，加入20 μL NADPH（終濃度1 mmol/L）啟動反應（該反應體系有機溶劑體積分數小于1%）。反應結束，加入 200 μL 冰甲醇終止反應，再加入200 μL 冰內標溶液，渦旋混合1 min，超聲3 min，15 000 r/min 離心10 min，取上清液，用于UPLC-MS/MS 定量分析。

1.2.5 UPLC-MSMS分析條件。

1.2.5.1 UPLC色譜條件。

色譜柱采用Waters BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），保護柱采用Waters Van Guard BEH C18（2.1 mm×5 mm，1.7 μm），流速為0.35 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣體積為2 μL，流動相為0.1%甲酸乙腈（A）與0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫條件為0 ～3.0 min，10%～65% A;3.0～3.5 min，65%～90% A;3.5～4.5 min，10% A。

1.2.5.2 MS質譜條件。

電噴霧電離源（ESI）;毛細管電壓：3 kV;離子源溫度：120 ℃;去溶劑氣溫度：600 ℃;去溶劑氣：N2，流速1 000 L/h;反吹氣：N2，流速50 L/h;碰撞氣：Ar，流速0.16 mL/min;質譜數據采集及處理軟件為MassLynx V 4.1工作站，掃描方式為多反應離子監測模式（MRM），條件見表1。

2 結果與分析

2.1 混合特異性抑制劑對大鼠肝微粒體中CYP450酶6個亞型的抑制作用

為了驗證體外微粒體孵育體系可行性，分別選取6個亞型的特異性抑制劑CYP1A2（α-萘黃酮）、CYP2E1（氯美噻唑）、CYP2D4（奎尼丁）、CYP2C19（噻氯匹定）、CYP2C11（氟康唑）、CYP3A2（酮康唑），取大鼠肝微粒體，按“1.2.3.3”方法操作，將抑制劑與探針底物共同孵育，測定代謝產物。通過Graph Pad Prime 5.0軟件擬合曲線并計算IC50值。結果發現（表2），特異性抑制劑IC50均在文獻報道[13-14]范圍內，提示該孵育體系方法合理可行。

2.2 葒草提取物對大鼠肝微粒體中CYP450酶6個亞型的抑制作用

用PBS將葒草提取物稀釋至8個濃度，使其加入孵育體系后的最終濃度分別為0.064、0.032、1.600、8.000、40.000、200.000、1 000.000、5 000.000 μg/mL，按“1.2.3.3”方法操作，將葒草提取物與探針底物共同孵育，每個濃度平行操作5次，測定代謝產物。以空白組的代謝物生成量為V0，探針代謝物生成量為Vc，剩余酶活性I=Vc/V0×100%，以剩余酶活性為縱坐標、葒草提取物的濃度為橫坐標，通過Graph Pad Prime 5.0軟件擬合曲線并計算IC50值。結果如圖1和表3所示，在臨床劑量下，葒草提取物對大鼠肝微粒體CYP2C19、CYP2D4有弱抑制作用，對CYP1A2有強抑制作用。葒草提取物對大鼠肝微粒體中CYP1A2、CYP2E1、CYP2D4、CYP2C19、CYP2C11 和CYP3A2的 IC50值在85.75～345.00 μg/mL。

3 討論與結論

該試驗使用UPLC-MS/MS建立了同時測定大鼠肝微粒體孵育體系中Cocktail混合探針藥物對應代謝產物（CYP3A2-睪酮/6β-羥基睪酮、CYP2C11-甲苯磺丁脲/羥基甲苯磺丁脲、CYP2C19-奧美拉唑/5-羥基奧美拉唑、CYP2D4-右美沙芬/右啡烷、CYP2E1-氯唑沙宗/6-羥基氯唑沙宗、CYP1A2-非那西丁/對乙酰氨基酚）的方法，該方法可特異、快速、準確、靈敏地測定孵育體系中的6個代謝產物。

試驗中，按“1.2.3.3”方法操作，考察不同大鼠肝微粒體濃度（0、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50 mg/mL）和不同孵育時間（0、5、10、15、30、45、60、90 min）與代謝物生成量的線性關系，結果顯示6種代謝產物的最佳蛋白濃度為1 mg/mL，最佳孵育時間為30 min。因此，試驗中選用1 mg/mL 的肝微粒體作為試驗對象，孵育時間為30 min。

假設藥物全部吸收經過肝臟代謝。臨床上，葒草有關制劑一次口服劑量轉化成生藥量為9～15 g/次，根據水提取物的轉化率（5.02%），9～15 g生藥相當于提取物0.45～0.75 g，以大鼠平均肝重、制得的平均微粒體重計算大鼠的給藥劑量為102.0～164.4 μg/mL。因此，葒草提取物對CYP2C19、CYP2D4有弱抑制作用，對CYP1A2有較強的抑制作用。前期研究表明，葒草提取物的主要成分為原兒茶酸、異葒草素、葒草素、牡荊素等酚酸類和黃酮類化合物[4]，在黃芩水提物對大鼠肝微粒體抑制作用的研究[15]中表明，黃酮類化合物對肝微粒體P450酶的亞型1A有強抑制作用，而葒草提取物作為黃酮類成分含量較多的水提物，對CYP1A2有強抑制作用。

綜上所述，臨床上使用葒草作為主要治療藥物或者輔助治療藥物時，要考慮到其對CYP2C19、CYP2D4的弱抑制作用以及對CYP1A2的強抑制作用，以避免用藥過程中對藥物的代謝產生抑制。

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