蕙蘭種子根狀莖培養與愈傷組織誘導

吳正景，高 文，馬鑫婷，高屹典，劉亞楠，楊芯賢，安冰潔

(1.河南科技大學 園藝與植物保護學院，河南 洛陽 471003;2.河南后博農業科技有限公司，河南 洛陽 471003)

蕙蘭(CymbidiumfaberiRolfe)為蘭科(Orchidaceae)蘭屬(Cymbidium)地生草本植物，花葶從葉基部抽出，幾乎直立或稍外露，花大多為淺黃綠色，具5～11朵或更多花的總狀花序，通常有香氣，在我國北方地區長勢優于春蘭。

目前關于蕙蘭組培方面的研究報道較少，主要因為蕙蘭對組培的條件要求較其他國蘭品種更為復雜，對其他國蘭的培養基配方適用性較差，在組培過程中容易發生褐化等問題。陳曉梅利用蕙蘭莖尖為外植體材料，通過誘導原球莖的形成建立起蕙蘭的離體快繁體系[1]；關仕港等人對金蕙進行了生根實驗，得到了最適合生根的培養基配方[2]；黃江等人用花莖和花芽，成功誘導出惠蘭的愈傷組織[3]；付秀琴發現在1/2MS培養基上，蕙蘭種子萌發率可達80%[4]。筆者通過種子無菌萌發，探討蕙蘭種子根狀莖的增殖、愈傷組織誘導條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蕙蘭種子采集自河南省南陽市桐柏縣，經河南科技大學園藝植物生物技術研究室無菌萌發，獲得蕙蘭種子根狀莖。

1.2 試驗方法

1.2.1 根狀莖增殖 蕙蘭萌發種子根狀莖誘導培養基為1/2 MS，添加蔗糖 20 mg·L-1，瓊脂 7.0 g·L-1，pH=5.7，激素處理見表1。每處理接種4瓶，重復3次。60 d后測定其根狀莖總數、分支數、增加長度、增殖率、褐變數、生長狀況6項指標。

表1 蕙蘭根狀莖增殖培養基

1.2.2 根狀莖分化出芽 蕙蘭根狀莖芽誘導培養基為MS，蔗糖15 mg·L-1，葡萄糖15 mg·L-1，瓊脂7.0 mg·L-1，pH=5.7，激素配方見表2。每處理接種3～4瓶，重復3次。40 d后測定其平均芽數、出芽率、平均長度、平均長葉數、褐化率、生長狀況。

表2 蕙蘭芽誘導培養基

1.2.3 根狀莖愈傷組織的誘導 接種時在惠蘭根狀莖表面劃出一個甚至多個傷口，以利于誘導愈傷組織的形成。每處理接種3～4瓶，重復3次。接種30 d后觀察愈傷誘導率、愈傷大小(長度)、生長狀況、褐化率、出芽率。

表3 蕙蘭根狀莖誘導愈傷組織培養基

續表3 蕙蘭根狀莖誘導愈傷組織培養基

2 結果與分析

2.1 不同有機添加物對蕙蘭根狀莖增殖的影響

由表4可知，添加香蕉泥的培養基比添加土豆泥的培養基，其上惠蘭根狀莖的增殖率、增加的長度、分支數更高，褐變數更少。因此，添加香蕉泥的培養基比添加土豆泥的培養基更適合惠蘭根狀莖的增殖。

表4 不同培養基對根狀莖增殖的影響

2.2 不同培養基對蕙蘭根狀莖分化出芽的影響

由表5可知，當培養基中的NAA濃度為2.0 mg·L-1時，惠蘭根狀莖出芽率均比接種于NAA1.0 mg·L-1的惠蘭根狀莖要長，同時其褐化率更低，生長狀況也較好。Y8處理中出芽率最高，達到87.5%，平均芽數為10.1，沒有出現褐化，說明培養基中單獨添加酪蛋白對蕙蘭出芽不利，而蛋白胨和酪蛋白同時添加時效果最好。

表5 不同培養基對蕙蘭根狀莖誘導出芽的影響

2.3 根狀莖的愈傷誘導

由表6可知，單獨添加2,4-D和單獨添加NAA的培養基均能誘導出愈傷組織，且當2.4-D的濃度為1.0 mg·L-1時，愈傷組織的誘導率可達33.3%；激素配方 0.5 mg·L-1NAA + 1.0 mg·L-12,4-D+6-BA1.0 mg·L-1誘導的愈傷活力較好；添加椰汁對誘導愈傷組織效果不明顯；培養基中加入1.0 g·L-1蛋白胨時，對于誘導惠蘭愈傷組織的形成效果最好，且誘導率比加入其他添加物的培養基要高，活力更強，且褐化率較低；KT對愈傷的誘導作用效果一般。

表6 不同培養基對蕙蘭誘導愈傷組織的影響

總之，在本次試驗中，蕙蘭誘導愈傷組織效果最好的培養基配方是GY15，其誘導愈傷率為45.0%，愈傷為綠色，沒有褐化現象的產生。

3 結論與討論

3.1 結論

添加香蕉泥的培養基比添加土豆泥培養基更適合惠蘭根狀莖的增殖；誘導蕙蘭根狀莖分化出芽的最佳培養基配方為:MS + 2.0 mg·L-1NAA + 4.0 mg·L-16-BA + 1.0 g·L-1酪蛋白 + 1.0 g·L-1蛋白胨 + 15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1葡萄糖 + 7.0 g·L-1瓊脂；誘導根狀莖誘導愈傷組織形成的最適培養基配方為：MS + 0.5 mg·L-12,4-D + 1.0 mg·L-1NAA + 1.0 mg·L-16-BA +100 g·L-1椰汁 +30g·L-1蔗糖+7.0g·L-1瓊脂。

3.2 討論

2,4-D可以增加蕙蘭根狀莖的愈傷組織誘導率，但需要2,4-D和其他生長素及細胞分裂素配合使用，效果更好。

Samira Chugh等研究中表明，椰汁包含多種營養和激素，經過高壓滅菌后與蘭花組培培養基的其他活性物質相容性高，能夠刺激愈傷組織或者原球莖的形成，提高細小片段外植體的存活率，調整原球莖分化過程[5]。筆者試驗發現 1.0 g·L-1的蛋白胨對誘導愈傷的效果最好，比加100 mL·L-1椰汁的效果更好。在誘導蕙蘭根狀莖出芽過程中，1.0 g·L-1蛋白胨和 1.0 g·L-1酪蛋白混合使用比單獨使用效果更好。