缺氧及缺氧再復氧對正常骨組織發生與發展的影響

王 歡，董 川，李 彬，王 偉，王 璞，馬 瓊，文艷華，劉云燕，馬保安

(1.空軍軍醫大學唐都醫院骨科，陜西 西安 710038；2.解放軍聯勤保障部隊第941醫院，青海 西寧 810007)

我國高原地區有其獨特的地勢地貌和氣候特點，其中低壓低氧環境對人類的健康有一定影響，不僅可以直接影響機體功能狀態，而且在機體受負荷刺激后，不同的地理環境因其氣壓等差異將產生不同的效應[1]，如呼吸加快、心率增快、紅細胞增多(血液黏滯性增加)等，同時也會出現消化系統、泌尿系統以及認知、記憶功能的減退，甚至發生高原相關疾病[2-6]。骨質疏松癥是一種多因素造成的慢性疾病[7-8]。目前的流行病學調查發現，高原地區人群骨質疏松癥發生率顯著高于平原地區，可能的影響因素包括氧氣濃度、日照、性別、年齡、體重、飲食習慣及基礎疾病等，其中氧氣濃度對于骨代謝的影響最為顯著[9-10]。高原低氧環境是否對骨組織有明確的影響，目前仍存在爭議。本研究通過觀察低氧與常氧環境中小鼠骨組織發生及發展是否存在差異，以及復氧能否改善低氧對骨組織的不良影響，進一步明確缺氧與骨質疏松之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性C57小鼠40只，體重16.5～24 g，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK(陜)2020-007。隨機分為常氧組(16只)、低氧組(16只)、及低氧轉常氧組(8只)。分籠飼養于實驗動物中心SPF動物房及低壓低氧艙，每籠4只，自由攝食、飲水，溫度22～26 ℃，濕度55%～65%，光照時間按照12 h間隔。

1.2 實驗主要設備和軟件 低壓低氧模擬實驗艙(中國貴州風雷航空軍械有限公司)；SysmexXE-2100全自動血細胞分析儀(日本SYSME東亞公司)；Micro-CT(GE)；生物力學試驗機(西安交通大學航空航天工程學院機械結構強度與振動國家重點實驗室)；圖形分析軟件(美國Autodesk公司)；石蠟切片機(德國Leica公司)；復合光學顯微鏡及照相系統(日本Olympas公司)。

1.3 動物模型制作及實驗流程 常氧組和低氧組分別飼養于常氧和低氧環境8周，而低氧轉常氧組于低氧環境飼養4周后轉至常氧環境飼養4周。三組小鼠前3 d分別置于動物飼養室及低壓低氧艙(正常大氣壓)內喂養以適應環境。第4天開始實驗，低壓低氧艙開始降壓，艙內空氣壓力設置為61.64 kPa，模擬海拔4000 m的大氣壓，氧分壓12.91 kPa，定期開倉投喂。常氧組仍于動物房內正常大氣壓下喂養。于4周和8周行心尖取血后將雙側股骨分離取出，右側先后行micro-CT及HE染色，左側行三點彎曲試驗。

1.4 血液學檢查 小鼠麻醉后由低壓低氧艙和動物飼養房移至手術室在心尖取血，標本收集后立即送至西京醫院門診檢驗科檢測血常規。

1.5 micro-CT檢測 小鼠斷頸處死后，取右側股骨置于福爾馬林溶液中-4 ℃保存。標本收集后統一行micro-CT檢測[11-12]。掃描參數：分辨率8 μm，球管電流80 mA，球管電壓80 kV，曝光時間3000 ms。掃描完成后，選取距離股骨遠端生長板1 mm處開始向近端高度2 mm范圍為感興趣區域行三維重建，使用Explore Reconstruction軟件進行重建定量分析[13]，檢測相對骨體積(BV/TV)、相對骨表面積(BS/TV)、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)[10]。

1.6 組織學觀察 將多聚甲醛固定后的右側股骨標本流水沖洗24 h，經10% EDTA脫鈣14 d，常規逐級酒精脫水、二甲苯透明、石蠟浸潤及包埋。用切片機5 μm連續切片，二甲苯脫蠟，HE染色，光鏡下觀察骨小梁分布以及面積、長度、厚度等[14]。

1.7 生物力學檢測 將在70%濕鹽水中保存的左側股骨用紗布擦干水分[15]。將股骨標本放置在生物力學實驗機上，實驗臺跨距6 mm，加載速率0.005 mm/s。在加載負荷過程中，機器實時記錄下載荷與位移參數，直到股骨發生斷裂。比較兩組生物力學性能[16-17]。

1.8 統計學方法 應用SPSS 17.0統計學軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，兩樣本均數比較用t檢驗，多樣本均數比較用方差分析，三組間兩兩比較采用Newman-Keuls法(q檢驗)， 多樣本間兩兩比較涉及重復測量時用Bonferroni校正。P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 三組小鼠體重及體重增量比較 見表1。各組小鼠在實驗前體重比較無統計學差異(P>0.05)。4周時低氧組與低氧轉常氧組小鼠體重及體重增量比較無統計學差異(均P>0.05)，但均低于常氧組(均P<0.05)。8周時三組小鼠體重比較無統計學差異(P>0.05)；常氧組與低氧轉常氧組體重增量比較無統計學差異(P>0.05)，但均高于低氧組(均P<0.05)。

表1 各組小鼠體重及體重增量比較(g)

2.2 三組小鼠血常規比較 見表2。4周時，低氧組紅細胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)及紅細胞壓積(HCT)均高于常氧組(均P<0.05)。8周時，低氧組RBC、Hb、HCT均高于常氧組和低氧轉常氧組(均P<0.05)，而常氧組與低氧轉常氧組上述指標比較均無統計學差異(均P>0.05)。

表2 三組小鼠血常規比較

2.3 三組小鼠4周及8周時微觀結構比較 見表3(圖1)。micro-CT三維重建結果顯示，4周時低氧組骨小梁出現斷裂、變短、網狀結構退化，空隙較大；常氧組骨小梁較粗，空隙較小，數量較多，連續性較好。8周時低氧組骨小梁斷裂、退化明顯，空隙明顯；低氧轉常氧組骨小梁空隙小且均勻，連續性較好。各參數量化分析結果顯示，4周時低氧組BV/TV、Tb.Th、Tb.N均低于常氧組，BS/TV高于常氧組(均P<0.05)；8周時低氧組BV/TV、Tb.Th、Tb.N均低于常氧組和低氧轉常氧組，BS/TV高于常氧組與低氧轉常氧組(均P<0.05)，而常氧組與低氧轉常氧組比較均無統計學差異(均P>0.05)。

表3 三組小鼠4周及8周時微觀結構指標比較

圖1 各組小鼠股骨干骺段4周(A)及8周(B)時二維平面及三維重建圖

2.4 三組小鼠股骨遠端HE染色結果比較 見圖2。標本均選擇股骨遠端靠近生長板處的松質骨進行觀察。4周時，可見低氧組骨小梁相對稀疏，常氧組骨小梁較為豐富。8周時，低氧組較常氧組和低氧轉常氧組明顯疏松，但常氧組與低氧轉常氧組無明顯差異。

圖2 三組小鼠股骨遠端4周(A)、8周(B)時HE染色結果

2.5 三組小鼠4周及8周時生物力學指標比較 見表4。4周時，低氧組股骨干最大力、剛度、最大應力以及楊氏模量均低于常氧組(均P<0.05)。8周時，低氧組股骨干最大力、剛度、最大應力以及楊氏模量均低于常氧組和低氧轉常氧組(均P<0.05)，但常氧組與低氧轉常氧組比較均無統計學差異(均P>0.05)。

表4 三組小鼠4周及8周時生物力學指標比較

3 討 論

高原環境是一個復雜的復合環境，其中低大氣壓、低氧、低溫、低濕、強太陽輻射等因素往往綜合作用于人體，對身體機能、消化系統、循環系統、泌尿系統、大腦功能(記憶和認知)等有明顯的影響。目前認為低壓低氧是其中重要且對機體影響較大的因素[18-19]，對骨發生及骨愈合的影響也不乏報道。

本研究著重觀察高原低壓低氧環境對小鼠正常骨發生、發展的影響，發現小鼠在缺氧環境較常氧環境中增長緩慢，紅細胞增多(血液黏滯性增加)，符合高原缺氧環境的表現。較低的體重被認為是降低氧耗量的適應性改變，而增多的紅細胞從另一方面增加了血液的攜氧能力，從而保證機體更好地適應低氧環境，這一結果與文獻報道[20-22]一致。低氧環境小鼠股骨遠端松質骨較常氧環境骨體積分數、骨小梁厚度、骨小梁數量顯著減少，骨表面積和組織體積比顯著增加，說明低氧環境中正常骨組織發生了微觀結構的改變，出現了骨質流失，傾向于發生骨質疏松，從而增加了發生骨折的風險。生物力學測試則說明了低氧環境中小鼠骨骼機械性能同時受損，其產生可能涉及多種機制。骨組織的正常發生、發展有賴于正常氧分壓下的局部微環境，當體內組織氧分壓下降，組織內的血管形成及細胞外基質沉積均會減弱，往往會影響骨組織的強度和質量。特別重要的是，低氧環境中的小鼠復氧后表現出了骨骼結構和功能的改善和恢復，與常氧環境無顯著差異，說明骨組織的發展很大程度上依賴于骨組織局部微環境中的氧分壓，而氧分壓的改變會影響多種骨細胞的相互作用，宏觀上表現為骨組織結構功能的改變。本研究選取小鼠股骨進行了micro-CT、HE染色和三點彎曲試驗等，結果提示在模擬高原低壓低氧的環境下小鼠正常骨組織的微觀結構和宏觀功能受到不同程度的影響，存在發展為骨質疏松的可能性，其產生可能涉及多種機制，復氧對骨骼結構和功能的恢復具有一定作用。

骨的發生、發展是一個動態平衡的過程，由成骨細胞、破骨細胞、骨髓間充質干細胞及骨髓腔內微環境共同完成。低氧環境下人體血氧濃度下降，骨髓腔內氧濃度也受到明顯影響。在此微環境的變化下，成骨細胞、破骨細胞及骨髓間充質細胞的代謝必然受到影響[23-25]。低氧環境下各種細胞因子與炎性介質的釋放打破了成骨與破骨的動態平衡，綜合因素下造成骨質流失[26-27]。本研究還發現在經過短期低氧環境已造成骨流失的情況下，復氧對于骨組織恢復正常的結構和功能尤為重要。因此，對于高原短期工作或任務人群，制定合理的高原環境中作業時間并及時有效地降高復氧對維持骨組織正常的平衡和保護原有的結構和功能具有重要意義。