rhNGF滴眼液與α1-AT注射液聯合應用對糖尿病視網膜病變模型大鼠的治療作用及機制的研究*

蔣偉，王妍，田建明，宋蓮蓮，韋康，章蓉*

（1. 深圳職業技術學院 應用化學與生物技術學院，廣東 深圳518055；2. 吉林省中醫藥科學院，吉林 長春130000）

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病嚴重并發癥之一，也是最常見的視網膜血管病，現已成為糖尿病患者致盲的首要原因，且目前沒有有效的預防方法而且治療后視力恢復是有限的[1]．最近的數據表明糖尿病視網膜神經變性（diabet-ic retinal neurodegeneration，DRN）可視為糖尿病眼部損害的一種主要表現形式，主要表現為視網膜微血管的改變，視網膜神經變性是導致DR的關鍵因素[2]．研究顯示在DR早期即未出現臨床癥狀表現時視網膜已經發生病理改變，因此眼科學研究各界均認同DR歸為視網膜神經退行性改變，臨床表現為視網膜神經纖維層（RNFL）不同程度的損傷[3-4]．相關研究證實，糖尿病患者視神經發生退行性病變是因神經營養因子轉運障礙以及被剝奪所致[5]．

神經生長因子（nerve growth factor，NGF）是具有神經元營養和促突起生長雙重生物學功能的一種神經細胞生長調節因子，在神經病變領域一直備受關注，對中樞及周圍神經包括視網膜細胞的發育、分化、生長，修復、再生和功能特性的表達有重要的調控作用，與視網膜生長、修復、死亡密切相關，現已證明神經生長因子可減少視網膜神經元凋亡、促進其生長發育[6-8]．有研究人員提出神經生長因子可以防治視網膜微血管的病理改變，預防視網膜神經節細胞的凋亡[9]．相關 DR的研究證實，外源性給予神經生長因子可以預防神經細胞退變，對視網膜神經節細胞直接起到保護作用，還可促進修復損傷[10]．α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin；α1-AT）是體內重要的絲氨酸蛋白酶抑制劑，被發現其能緩解胰腺炎和胰島素自身抗體的水平[11]．它的基因導入I型糖尿病小鼠體內能減弱T細胞免疫介導的β細胞損傷，表明α1-AT在治療I型糖尿病減緩胰島移植排斥反應方面意義重大[12]．本研究通過建立大鼠糖尿病眼病模型，采用外源滴眼液的給藥方式，首次以 rhNGF與 α1-AT相結合的方式檢測DR大鼠模型的血清生化指標、細胞因子、組織蛋白水平的變化及相關臟器的病理組織來探索治療 DR，為 DR的安全性和有效性的治療做初步的探討．

1 實驗材料

1.1 受試藥物

重組人神經細胞生長因子 rhNGF凍干粉，100μg/瓶，臨用前用PBS配成10μg/ml濃度的滴眼液，深圳職業技術學院提供，批號 170601；α1-AT注射液，濃度5104.5μg/ml，深圳職業技術學院提供，批號170301；鹽酸二甲雙胍緩釋片，上海普康藥業有限公司，0.5g/片×24片，批號150906．

1.2 實驗動物、飼料及飼養環境

SD大鼠100只，雄性，體重200-220g，購自遼寧長生生物技術有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001；

維持飼料，購自北京科澳協力飼料有限公司，批號17023211；

高糖高脂飼料配制：基礎飼料61.5%、膽固醇2.5%、膽酸鈉1%、蔗糖20%、豬大油10%、蛋黃粉5%．

飼養環境：吉林省中醫藥科學院清潔級屏蔽環境動物室，環境設施合格證：SYXK（吉）2015-0009，溫度20℃～24℃，相對濕度40%～70%．

1.3 儀器

SD-300生化分析儀，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；FA1004N型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；Leica RM2255型石蠟切片機，德國Leica公司；Leica EG1140石蠟包埋機，德國Leica公司；OlympusBX51光學顯微鏡，日本Olympus公司；NIS-ELEMNT BR型圖像分析系統，日本NIKON公司．

1.4 試劑

鏈脲佐菌素，純度>99%，美倫生物提供，Lot:M0115A Case:18883-66-4 P.N.:MB1227. 儲存：2-8℃，防潮密閉避光；弗氏完全佐劑，Freund’s Adjuvant Complete，LOT:SLBR3877V,SIGMAALORICH．

葡萄糖(GLU)試劑盒，批號 141516015，購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司．

ELISA試劑盒：白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、內皮素-1（ET-1）、一氧化氮合成酶（NOS）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、前列環素（PGI2）、糖化血紅蛋白（GHb），均為北京愛媚麗生物科技有限公司-分裝美國RD公司．

免疫組化試劑盒：AGE抗體（批號：07104325）、RAGE抗體（批號：07157076）、P物質抗體（批號：07010728）、ICAM-1抗體（批號：07141214）、CD80抗體（批號：07043032）、IL-12抗體（批號：07202594）、IL-33抗體（批號：72014581），均購自北京博奧森生物科技有限公司．

2 實驗方法

2.1 劑量設計

鹽酸二甲雙胍緩釋片臨床用量，2片（1000mg）/人/日，即 14.29mg/kg，折算成大鼠的等效劑量為95mg/kg；

rhNGF滴眼液臨床用量每人每日平均10μg，折算成大鼠的等效劑量為0.95μg/kg，每日1次，滴眼給藥；

受試藥α1-AT注射液腹腔注射給藥，每周2次，劑量11.5mg/kg．

2.2 造模及分組

取雄性大鼠若干只，體重180～200 g，留出10只做正常對照組外，其余90只給予高糖高脂飼料喂養，2周后ip鏈脲佐菌素25 mg/kg，第2天ipCFA（弗氏完全佐劑）0.1ml/只，誘導糖尿病眼病模型，每周1次，連續3周，第3次ip后3天測定血糖1次，以餐后血糖值≥16mmol/L且<20mmol/L為模型復制成功，將成模的大鼠按血糖值均分5組：模型組、二甲雙胍片組、rhNGF滴眼液組、rhNGF滴眼液+α1-AT注射液組、二甲雙胍片+α1-AT注射液組，另設一正常對照組[13]．

2.3 給藥及給藥周期

二甲雙胍片組按95mg/kg的劑量灌胃，每日1次；rhNGF滴眼液組按0.24μg/只的劑量滴眼，每日1次；α1-AT注射液組按11.5mg/kg的劑量腹腔注射，每周2次；rhNGF+α1組：rhNGF滴眼液按0.95μg/kg的劑量每日滴眼，每日1次，α1-AT按11.5mg/kg的劑量腹腔注射，每周2次；二甲雙胍片+α1-AT組：二甲雙胍片按95mg/kg的劑量每日灌胃1次，α1-AT按11.5mg/kg的劑量每周腹腔注射2次．

給藥周期為5周，給藥期間繼續用高糖高脂飼料喂養，末次給藥后8h后開始禁食、24h后開始處理動物．

2.4 測試指標

2.4.1 血清生化、各相關細胞因子

①血糖、糖化血紅蛋白：血糖（GLU）、糖化血紅蛋白（GHb）；

②血清炎癥細胞因子：腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）；

③血管內皮功能相關因子：內皮素-1（ET-1）、一氧化氮合成酶（NOS）；

④血管緊張素相關因子：血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、前列環素（PGI2）；

2.4.2 各相關免疫組化指標

SABC法檢測各組大鼠視網膜中 AGE和RAGE表達的變化，檢測視網膜色素上皮細胞免疫調控因子SP（P物質），ICAM-l（細胞粘附分子），CD80，IL-12和IL-33的組織蛋白水平的變化；

2.4.3 病理組織學檢查

剖取大鼠肝、胰腺、腎等快速浸于10%中性福爾馬林溶液中固定，做病理組織學檢查備用；剝取大鼠視網膜浸于10%中性福爾馬林溶液中固定，做免疫組化備用．

2.5 數據處理

各項指標用±s表示，采用統計軟件 SPSS（17.0），進行組間單因素方差分析（Oneway ANOVA）．

3 結 果

3.1 對糖尿病眼病大鼠相關血清生化、細胞因子的影響

3.1.1 對血糖、糖化血紅蛋白的影響

表1顯示，大鼠造成糖尿病眼病模型后，GLU、GHb明顯升高（與正常組比較：P<0.01～P<0.001）．使用受試藥物治療5周后，rhNGF+α1-AT組、二甲雙胍片+α1-AT組的GLU和GHb均得到明顯控制（與模型組比較：P<0.05）．

表1 對血糖、糖化血紅蛋白的影響（±s）

表1 對血糖、糖化血紅蛋白的影響（±s）

【注】與正常組比較：▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

組別 n GLU(mmol/L) GHb(ng/mL)模型組 8 28.76±2.87▲▲▲ 676.13±135.91▲▲二甲雙胍片組 11 20.99±7.86** 542.28±181.25 rhNGF滴眼液組 10 27.77±7.07 639.43±216.24 rhNGF+α1-AT組 10 22.02±4.52* 456.93±197.19*二甲雙胍片+α1-AT組 10 22.13±6.27* 471.90±151.46*正常組 10 8.11±0.92 391.91±157.76

3.1.2 對炎癥細胞因子的影響

表2顯示，大鼠造成糖尿病眼病模型后，TNF-α、IL-6、顯著升高（與正常組比較：P<0.01～P<0.001）．使用受試藥物治療5周后，各治療組TNF-α均有明顯改善（與模型組比較：P<0.05），但各治療組對IL-6均無明顯影響．

表2 對血清炎癥細胞因子的影響（±s）

表2 對血清炎癥細胞因子的影響（±s）

【注】與正常組比較：▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

組別 n TNF-α(pg/mL) IL-6(pg/mL)模型組 8 410.79±93.47▲▲▲ 240.52±45.88▲▲二甲雙胍片組 11 314.53±77.13* 184.13±21.27 rhNGF滴眼液組 10 307.79±107.80* 215.16±72.14 rhNGF+α1-AT組 10 270.89±81.97** 204.86±41.14二甲雙胍片+α1-AT組 10 303.30±83.43* 198.06±103.79正常組 10 233.03±63.38 144.04±67.43

3.1.3 對血管內皮功能相關因子的影響

表3顯示，大鼠造成糖尿病眼病模型后，ET-1、NOS顯著升高（與正常組比較：P<0.01～P<0.001），使用受試藥物治療5周后，僅二甲雙胍片+α1-AT組對ET-1、NOS有明顯改善（與模型組比較：P<0.05）．

表3 對血管內皮功能相關因子的影響（±s）

表3 對血管內皮功能相關因子的影響（±s）

【注】與正常組比較：▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001；與模型組比較：*P<0.05

組別 n ET-1(pg/mL) NOS(umol/L)模型組 8 390.94±50.75▲▲▲ 85.40±19.48▲▲二甲雙胍片組 11 327.80±78.63 67.61±18.11 rhNGF滴眼液組 10 323.66±79.62 73.37±27.34 rhNGF+α1-AT組 10 323.44±96.83 74.19±20.03二甲雙胍片+α1-AT組 10 276.56±79.08* 63.89±26.17*正常組 10 144.04±67.43 56.96±15.11

3.1.4 對血管緊張素相關因子的影響

表4顯示，大鼠造成糖尿病眼病模型后，AngⅡ顯著升高（與正常組比較：P<0.01），PGI2顯著下降（與正常組比較：P<0.05），使用受試藥物治療5周后，二甲雙胍片組、rhNGF滴眼液組、二甲雙胍片+α1-AT組對AngⅡ有明顯改善（與模型組比較：P<0.05），但各治療組對PGI2均無明顯影響．

表4 對血管緊張素相關因子的影響（±s）

表4 對血管緊張素相關因子的影響（±s）

【注】與正常組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較：*P<0.05

組別 n AngⅡ(pg/mL) PGI2(pg/mL)模型組 8 580.82±110.91▲▲ 201.03±28.31▲二甲雙胍片組 11 451.08±131.99* 225.37±21.75 rhNGF滴眼液組 10 476.43±113.94* 211.04±48.87 rhNGF+α1-AT組 10 489.86±76.29 221.77±65.55二甲雙胍片+α1-AT組 10 464.74±105.37* 220.98±37.04正常組 10 429.22±103.29 253.94±44.40

3.2 對糖尿病眼病大鼠視網膜中相關免疫組化指標的影響

3.2.1 對AGE與RAGE表達量的影響

圖1顯示AGE與RAGE在正常組表達量較少，在模型組中表達較多（P<0.05），二甲雙胍片組表達降低，在 rhNGF組、rhNGF+α1-AT組和二甲雙胍片+α1-AT組表達減少，這兩組與模型組比較差異顯著（P<0.05）．

圖1 各實驗組糖尿病眼病大鼠視網膜中AGE、RAGE、P物質、ICAM-l、CD80、IL-12、IL-33的表達平均光密度值（±s）

3.2.2 對P物質表達量的影響

P物質陽性表達主要集中在神經節細胞層、內核層和內叢狀層，在細胞核，細胞胞漿也有部分陽性表達，其表達物呈棕色．正常對照組內核層及神經節細胞層可見一些 P物質陽性表達細胞．在模型組中表達較多（P<0.05），二甲雙胍片組表達降低，在 rhNGF組、rhNGF+α1-AT組和二甲雙胍片+α1-AT組表達減少，rhNGF+α1-AT組和二甲雙胍片+α1-AT組與模型組比較有顯著性差異（P<0.05）（見圖1）．

3.2.3 對ICAM-1表達量的影響

ICAM-1陽性顆粒位于視網膜毛細血管內皮細胞膜表達量較多，呈棕黃色．對照組顆粒數量少且呈淺黃色，表明ICAM-1表達較少．在模型組中表達較多（P<0.05），二甲雙胍片組表達降低，在rhNGF組、rhNGF+α1-AT組和二甲雙胍片+α1-AT組表達減少，rhNGF+α1-AT組和二甲雙胍片+α1-AT組與模型組比較有顯著性差異（P<0.05）（見圖1）．

3.2.4 對CD80表達量的影響

CD80在正常對照組視網膜中表達較低．在模型組中表達較多（P<0.05），二甲雙胍片組表達降低，在 rhNGF組、rhNGF+α1-AT組和二甲雙胍片+α1-AT組表達減少，且后兩組與模型組比較差異顯著（P<0.05）（見圖1）．

3.2.5 對IL-12、IL-33表達量的影響

IL-12與 IL-33在正常對照組視網膜中表達較低．在模型組中表達較多（P<0.05），二甲雙胍片組表達降低，在 rhNGF組、rhNGF+α1-AT組和二甲雙胍片+α1-AT組表達減少，且后兩組與模型組比較差異顯著（P<0.05）（見圖1），視網膜免疫組化表達結果如圖2所示．

圖2 視網膜免疫組化各物質表達結果

3.3 組織病理學檢測結果

組織病理學檢測結果顯示：rhNGF組除視網膜外，肝臟、腎臟、胰腺與模型組比較均無明顯改善，但與α1-AT合用時肝臟、腎臟、胰腺均有改善．具體結果參見表5．

表5 組織病理學檢查結果

4 討 論

糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病的常見并發癥，也是糖尿病患者失明的主要原因．視網膜神經改變（DRN）在DR微血管損傷中發揮著重要的作用，被認為與神經纖維變性、神經細胞凋亡等因素密切相關[14]．而神經生長因子（NGF）可通過降低糖尿病視網膜氧化應激，抑制視網膜細胞凋亡，恢復視網膜突觸數量[15]．α1-胰蛋白酶抑制劑（α1-AT）能夠改善Ⅰ型糖尿病免疫性胰島炎并且減緩胰島移植排斥反應[16]．本文通過外援滴眼給藥的方式，直接將rhNGF作用于眼部視網膜，同時聯合注射α1-AT來監測受試大鼠的一系列血清及免疫、病理指標，發現rhNGF滴眼液單獨使用時，對血清 TNF-α、AngⅡ等指標有明顯的改善作用；與α1-AT合用時，對血清GLU、GHb、TNF-α等指標亦有明顯的改善作用．

視網膜上的AGEs與其受體（RAGE）在DR發展過程中發揮重要作用．機體長期處于高血糖狀態，可導致糖基化反應即生成加速 AGEs，直接影響血管壁和基底膜結構的完整性，也可與其受體相互作用，激活多個信號轉導通路，促進血管病變的發展，從而在糖尿病血管并發癥中發揮致病效應[17]．本次試驗中，在 NGF組、rhNGF+α1-AT組和二甲雙胍+α1胰蛋白酶抑制劑組中AGE與RAGE表達均有所減少．說明rhNGF可以通過調節視網膜局部生化代謝過程，影響局部視網膜的 AGE與 RAGE表達，但是rhNGF+α1-AT組中AGE與RAGE的表達量低于rhNGF組，推測rhNGF組對局部AGE與RAGE的表達量的影響，不及全身血糖下降作用的強度大；也說明單獨依靠rhNGF滴眼的作用可能是有限的，聯合用藥的方式效果更顯著．

P物質（substance P，SP）存在于視網膜組織，具有致炎性和免疫刺激作用[18]．有研究觀察到機體應激狀態下，視網膜組織內P物質表達上調，可能對視網膜組織及其功能產生影響，與臨床眼科免疫、炎癥性病變有關[19]．本次實驗顯示，rhNGF組中P物質表達減少，即rhNGF對糖尿病視網膜中P物質具有調節作用．CD80、IL-12與IL-33在大鼠糖尿病視網膜病變中的原位表達，國內外文獻中尚未見明確報道[20]．本次研究發現，正常視網膜中CD80、IL-12與IL-33的表達較低，模型組其表達量明顯上調，T細胞活化和視網膜免疫活性的改變都可能與糖尿病視網膜病變有關．本次實驗中，給予rhNGF可以減少CD80、IL-12與IL-33在大鼠原位糖尿病視網膜病變中的表達量，說明rhNGF可以通過局部免疫調節減少視網膜的免疫損傷．

綜上所述，rhNGF對 DR的大鼠模型中 AGE和RAGE的表達有一定的影響，同時可以通過干預視網膜神經免疫相關的細胞因子，如 P物質、ICAM-1、CD80、IL-12和IL-33的表達，在糖尿病視網膜病變中得以保護視網膜．此外，亦有研究表明 α1胰蛋白酶抑制劑可以通過抑制巨噬細胞的遷移來對I型糖尿病的進行治療[21-22]．通過構建能穩定表達hα1-AT的胰島β細胞系（NIT?hα1-AT），移植該細胞系后能穩定表達胰島素并維持血糖呈正常水平至35 d，表明hα1-AT的表達可抑制受體對移植細胞系的免疫排斥反應，不僅延長了移植細胞的存活時間，而且具有抗凋亡和誘導特異性免疫耐受的特性[23]．近年來研究發現胰島素抵抗在Ⅱ型糖尿病發病中起重要作用，而α1-AT可能是影響白蛋白-胰島素結合的最重要的病理因素之一，α1-AT可通過與胰島素競爭白蛋白上的結合位點而發揮競爭性抑制作用，通過抑制白蛋白和胰島素的結合，促使胰島素從胰島素-白蛋白復合物中解離和利用，從而起到調節血糖水平的作用[24-25]．因此，在針對DR的治療方面，本研究首次采用rhNGF和α1-AT相結合的方式給藥，結果顯示兩者結合給藥比單獨 rhNGF給藥對血清相關因子的改善更為明顯．本研究對rhNGF和α1-AT在糖尿病視網膜疾病中神經細胞的保護作用提供了一定理論依據，但是兩種藥物聯合給藥比 rhNGF單獨給藥發揮更好效果的作用機制，還需要在分子生物學，蛋白組學等多個層面、多個環節進一步研究和探討．