七氟烷預處理聯合后處理對大鼠肺缺血再灌注損傷時核轉錄因子κB(NF-κB)及內皮素-1(ET-1)的影響

杜 寧,于 飛，常文麗

(濱州醫學院附屬醫院，山東 濱州 256600)

減輕肺缺血再灌注損傷治療是目前研究的熱點。七氟烷在臨床麻醉工作中應用廣泛，七氟烷預處理對肺組織的缺血再灌注損傷有減輕作用，但相關機制不明確。有研究報道，組織損傷時ET-1大量釋放，ET-1介導的炎性反應、氧化應激等加重組織損傷[1]。組織缺血再灌注損傷復雜反應中，NF-κB[2]在這過程中發揮重要作用，NF-κB能調控上游的炎性介質，其調節的轉錄產物又是缺血再灌注損傷炎性反應的主要炎性介質，因而其可能成為缺血再灌注損傷時炎性反應調節的樞紐。本研究擬探討肺缺血再灌注損傷對NF-κB p65 mRNA及ET-1表達影響，從而闡述肺組織的缺血再灌注的損傷可能機制。

1 資料與方法

1.1一般資料：實驗動物及分組：選取54只成年并且健康的SD大鼠(由來自新疆醫科大學的動物實驗室，本次研究經過醫學倫理委員會同意)，體重維持在250～350 g。按照隨機對照原則進行分組，共分為三組(n=18):假手術組(S組)、肺缺血再灌注組(I/R組)、七氟烷預處理與后處理聯合組(SPr+o組)。

1.2模型的制備：按照Bellido-Reyee YA提出的改良的Epinger方法[3]制備肺缺血再灌注損傷模型。腹腔注射烏拉坦麻醉，麻醉效果滿意后，大鼠采取仰臥位，用線繩固定四肢，頸部備皮后采取正中切口，玻璃分離鉗分離出氣管、頸靜脈，小號手術刀謹慎行如下操作：氣管切開、氣管插管以及頸靜脈插管，接呼吸機行機械通氣(成都泰盟科技有限公司)，選擇潮氣量大小為10～15 ml/kg，通氣頻率為70～80次/min，吸∶呼比為4∶5，靜脈輸注0.6 mg/(kg·h)的維庫溴銨，大鼠給予30 min呼吸機輔助通氣，采取右側臥位，分離鉗從大鼠左側第5肋間入胸腔，分離出左肺門，注射50 U肝素，5 min后，于肺的呼氣末應用血管夾夾閉左側肺門。阻斷肺門45 min后，松開血管鉗，恢復血液灌注和通氣從而完成缺血再灌注模型。S組僅暴露大鼠左肺門；I/R組止血鉗阻斷大鼠的左肺門45 min松開止血夾，恢復血液灌注，制備大鼠的肺缺血再灌注的模型；Spr+o組在止血鉗夾閉前即缺血前給予2.1%七氟烷吸入30 min，純氧洗脫10 min，止血鉗阻斷左肺門45 min后，在松開止血鉗恢復血液灌注的同時吸入30 min的2.1%七氟烷，再灌注90 min。實驗結束后三組分別在再灌注30 min、60 min、120 min這三個時間點做心臟采血；取部分左肺組織進行甲醛固定，用石蠟包埋，液氮速凍后冰箱保存。

1.3左肺組織W/D的測定:切肺組織(約100 g)稱濕重,再放在風箱(80℃)(北京市永光明醫療儀器廠)12 h測干重,計算肺組織W/D比。

1.4血漿ET-1含量測定:取部分冰箱保存血液，3 000 r/min離心10 min后取上清，用ELISA法測定ET-1的含量，ET-1測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.5肺組織NF-κB p65 mRNA表達：肺組織在-80℃冰箱保存，取部分肺組織，采用Trizol法處理、分離、RNA沉淀、RNA洗滌、RNA溶解提取總RNA并測定其濃度和純度，逆轉錄試劑盒(Thremo公司)合成反轉錄cDNA，然后進行RT-PCR反應。核轉錄因子κB(424bp)上游引物：5'-GCGCATCCAGACCAACAATAA-3'，下游引物：5'-GCCGAAGCTGCATGGACACT-3'；β-actin(372bp)上游引物：5'-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3'，下游引物：5'-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3'。取5μlPCR產物點樣在2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，用凝膠圖像分析系統(Bio—Rad公司，美國)掃描測定PCR擴增條帶的吸光度值，以核轉錄因子κB的條帶吸光度值與β-actin的條帶吸光度值的比值來表示NF-κB p65 mRNA的表達水平。

1.6肺組織病理學檢查：取左肺上葉小組織塊，采用10%甲醛予以固定，采用石蠟包埋，組織切片，蘇木精—伊紅染色法染色，光鏡下觀察肺組織形態學的變化。

2 結果

2.1七氟烷預處理聯合后處理對肺組織濕干重比(W/D)的影響：與S組比較，Spr+o組和I/R組在缺血再灌注各時點肺組織W/D比值升高(P<0.05)。與I/R組比較，Spr+o組在缺血再灌注各時點W/D比值降低(P<0.05)。與在缺血再灌注30 min比較，再灌注60 min、120 min時I/R組和Spr+o組肺組織W/D比值均升高(P<0.05)。與在缺血再灌60 min時比較，再灌注120 min時I/R組和Spr+o組肺組織W/D比值升高(P<0.05)。S組上述W/D比值在再灌注30 min、60 min、120 min比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 三組大鼠各時點肺組織W/D表達水平的比較

2.2七氟烷預處理聯合后處理對肺ET-1及NF-κB p65 mRNA的影響：與S組比較，Spr+o組和I/R組在缺血再灌注30 min、60 min、120 min時點ET-1及NF-κB p65 mRNA增高(P<0.05)。與I/R組比較，Spr+o組在缺血再灌注30 min、60 min、120 min時點ET-1及NF-κB p65 mRNA下降(P<0.05)。與再灌注30 min相比，再灌注60 min，120 min時I/R組和Spr+o組ET-1及NF-κB p65 mRNA都升高(P<0.05)。與再灌60 min時比較，再灌注120 min時I/R組和Spr+o組ET-1及NF-κB p65 mRNA都升高(P<0.05)。S組上述指標在缺血再灌注30 min、60 min、120 min時點比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 三組大鼠各時點血漿ET-1、肺組織NF-κB p65 mRNA表達水平的比較

2.3肺組織形態學觀察：光鏡下觀察：S組肺組織和肺間隔比較完整，炎性反應滲出比較少，炎性細胞、紅細胞較少。IR組在再灌注后肺組織結構破壞較為嚴重，部分組織細胞壞死，炎性細胞浸潤，肺泡腔內有滲出的紅細胞、炎性細胞(見圖1)。Spr+o組肺組織損傷的病理改變較IR組明顯減輕，紅細胞、炎細胞滲出減少。

注：A為S組再灌注30 min時；B為S組再灌注60 min時；C為S組再灌注120 min時；D為I/R組再灌注30 min時；E為I/R組再灌注60 min時；F為I/R組再灌注120 min時；G為SPr+o組再灌注30 min時；H為SPr+o組再灌注60 min時；I為SPr+o組再灌注120 min時

3 討論

目前，缺血再灌注損傷在心、腦、腎等臟器的研究中較廣泛[4-5]，但肺缺血再灌注損傷機理尚不清楚。有研究報道，NF-κB參與了心肌缺血再灌注損傷，同時也證實NF-κB的抑制物在心臟缺血再灌注損傷起到了保護作用[6]。缺血再灌注損傷機理復雜，包括凋亡、炎性反應、氧自由基等機理參與，而最近報道中發現NF-κB是復雜的機理中的“焦點”，NF-κB 轉錄的炎性介質和細胞因子，如TNF-α、IL-8，在缺血再灌注損傷中發揮重要的作用，且這些炎性因子與 NF-κB構成正反饋調節環，即誘導產生的炎性因子可進一步刺激更多NF-κB 通路的開放，這對炎性反應發揮了級聯放大的作用，加重了組織的損傷。缺血再灌注損傷中微循環障礙發揮重要作用，肺缺血再灌注時，NF-κB介導的大量炎性細胞釋放，破壞了內皮細胞的完整性，血管壁通透性增加，導致肺組織的損傷與水腫[7]。NF-κB促進炎性介質大量釋放及誘導微循環障礙，成為缺血再灌注損傷的樞紐。NF-κB調控的下游基因已證實ET-1等基因的啟動子區域或其上游臨近區域存在結合位點[8],這些證據都說明能夠直接或間接的在基因轉錄水平上，調控表達。

ET 在肺損傷發揮重要作用，其機理可能如下：①ET誘導鈣離子內流導致鈣超載引起縮血管效應，導致組織缺血、缺氧；②ET 增加氧自由基釋放，一方面促白細胞聚集產生氧自由基，另一方面 ET 引起鈣超載會進一步促進炎性細胞釋放包括氧自由基在內的促炎介質，導致損傷組織細胞；③ET 可引起中性粒細胞在組織聚集，造成器官損害。有研究報道，ET-1可以加重肺臟的缺血再灌注損傷[9]。而研究發現ET-1拮抗劑減輕肺缺血再灌注損傷[10]。

綜上所述，肺缺血再灌注損傷時肺組織的W/D比在再灌注30 min、60 min、120 min時點均升高，提示肺毛細血管的通透性增高。缺血在灌注損傷的肺組織HE染色見IR組再灌注后肺組織結構破壞，炎性細胞浸潤，肺泡腔內大量滲出的紅細胞、炎性細胞。NF-κB及ET-1在IR時表達均顯著升高，提示炎性反應在肺組織的缺血再灌注損傷中發揮重要作用。七氟烷預處理聯合后處理組NF-κB及ET-1表達水平較IR組下降，提示七氟烷預處理聯合后處理減少肺組織局部中性粒細胞浸潤,減輕炎性反應,減輕肺水腫,從而起到保護肺組織作用。

通過本實驗的研究,我們認為七氟烷預處理聯合后處理可以減輕大鼠肺的缺血再灌注損傷,其減輕對再灌注后肺組織損傷機制可能與減少 NF-κB及ET-1的表達有關。