基于氣相離子遷移譜的發酵海帶風味分析

邵悅春，付曉婷，許加超，高 昕

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003）

海帶（Laminaria japonica），又名綸布、江白菜、昆布，是一種生長于低溫海域中的多年生大型食用藻類，隸屬褐藻門（Phaeophyta）、海帶科（Laminariaceae）海帶屬（Laminaria）[1]。在亞洲，尤其是我國、日本、韓國等國家，海帶因其豐富的營養及獨特的風味成為人們喜愛的食用藻類之一[2]。除了用作食品原料外，海帶還具有較高的經濟價值，能夠作為工業上提取褐藻膠、甘露醇、碘的原料，其中褐藻膠作為廣泛應用的食品添加劑被加入到各種食品中[3]。同時，海帶中富含多種活性物質如褐藻膠、褐藻糖膠、海藻多酚等，這些活性物質使得海帶有降血脂、降血糖、抗癌和提高免疫力等功效，在醫藥領域具有較大的潛力與價值[4]。

我國是全球海藻養殖及其加工利用規模最大的國家，海帶產量約占世界產量的80%，位居世界首位[5]。我國海帶產量雖逐年增長，但其加工程度低，主要以傳統的初級產品為主[6]。由于海帶細胞壁中存在大量如褐藻膠等的多糖，其水溶性較差，同時海帶中的呈味物質以及功能因子被膠體緊密包裹，不易溶出和提取，因此海帶中活性成分提取在很大程度上被制約[7]。可見，探索海帶的深加工技術，是我國海帶產業可持續發展的重要方向[8]。

發酵指的是在微生物的作用下，復雜的有機化合物被分解成比較簡單的物質的一種生物氧化方式，其過程是微生物和酶所引起的一系列復雜的生化反應[9]。使用發酵方法加工食品的歷史悠久且優點顯著，如發酵可產生醇類、氨基酸、酯類和有機酸等物質使產品具有獨特的風味及色澤。目前，大多數發酵的海洋食品是由魚和蝦等動物材料制成的，使用發酵方法加工的海藻類產品較少，還處于起步階段，國內主要產品為海藻發酵酒、海藻發酵飲料、海藻發酵醬等[10]。

氣相色譜-離子遷移譜聯用（gas chromatographyion mobility spectroscopy，GC-IMS）是一種將氣相色譜和離子遷移譜結合的檢測技術，用于分析樣品中的揮發性化合物，首先利用氣相色譜對待測樣品進行預分離，然后通過離子遷移譜進行揮發性組分的分析[11]。該方法不但使得離子遷移譜的信號響應質量得到顯著提高，又使得氣相色譜分離后所得的化學信息更加豐富，充分發揮了兩種技術各自的優點。該技術具有簡單、快速、靈敏的優點，目前已廣泛應用于食品風味分析、品質評價、環保安全等多個生命化學領域[12]。近年來，國內外利用GC-IMS 進行食品風味的研究主要集中在植物油[13]、菌類[14]、肉制品[15]、魚類[16]等風味豐富的物質。目前尚未見GC-IMS 應用于發酵海帶風味物質檢測的報道。

本研究以不同條件下發酵后所得6 個發酵海帶樣品及發酵前的海帶樣品為研究對象，采用GC-IMS的方式進行揮發性風味成分分析，探究其風味物質組成成分及相對含量的變化，將風味成分所發生的變化以可視化的方式表現出來。通過比較不同糖鹽含量和不同菌種發酵前后海帶風味所發生的變化，為促進海帶的高值化利用、改善其風味提供新方法、新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干海帶 金鵬旗艦店，原料來自榮成海域；泡菜酸菜乳酸菌發酵粉 北京川秀科技有限公司；安琪高活性干酵母粉 安琪酵母股份有限公司；綿白糖 青島華潤澤食品有限公司；食鹽 青島鹽海制鹽有限公司。

LDZM-80L 立式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；DWP-9082 電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；SW-CJ-1FD 潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；Flavour Spec? 風味分析儀 德國G.A.S 公司；CTC-PAL 自動頂空進樣器 瑞士CTC Analytics 公司；SE-54 毛細管柱（規格：15 m×0.53 mm×1.0 μm） 德國CS-Chromatographie Service 設備供應商。

1.2 實驗方法

1.2.1 海帶的預處理 干海帶從中肋處對稱分成兩半，一半用于后續發酵處理，另一半作為未發酵的海帶對照樣品。將干海帶洗凈后于60 ℃復水2～3 h。復水后的海帶瀝水，切成約4 cm×4 cm 方片狀，置于滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，滅菌完成后冷卻備用。

1.2.2 菌種活化

1.2.2.1 乳酸菌活化 1 g 乳酸菌菌粉（泡菜酸菜乳酸菌發酵粉，包括植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）加入到100 mL 滅菌水中，37 ℃培養活化12 h。

1.2.2.2 酵母菌活化 2 g 酵母粉加入到50 mL 滅菌2%糖水中，28 ℃活化培養1 h。

1.2.3 發酵實驗

1.2.3.1 無菌糖鹽水制備 將12 g 綿白糖與12 g 食鹽加入300 mL 超純水中，即4%糖鹽水；將18 g 綿白糖與18 g 食鹽加入300 mL 超純水中，即6%糖鹽水。將4%糖鹽水、6%糖鹽水置于滅菌鍋中，121 ℃滅菌20 min，滅菌完成后冷卻備用。

1.2.3.2 乳酸菌發酵 將200 g 滅菌后的海帶片分別與300 mL 不同濃度（4%、6%）滅菌糖鹽水在無菌操作臺中混合，按菌種使用說明中1 g 乳酸菌粉發酵1 kg 樣品的比例，每200 g 海帶樣品中加入300 mL糖鹽水及20 mL 活化后的乳酸菌液，密封后于30 ℃發酵10 d。

1.2.3.3 酵母菌發酵 將200 g 滅菌后的海帶片分別與300 mL 不同濃度（4%、6%）滅菌糖鹽水在無菌操作臺中混合，同時加入50 μL 活化后的酵母菌液，密封后于30 ℃發酵10 d。

1.2.3.4 乳酸菌與酵母菌復合發酵 將200 g 滅菌后的海帶片分別與300 mL 不同濃度（4%、6%）滅菌糖鹽水在無菌操作臺中混合，同時加入20 mL 活化后的乳酸菌液和50 μL 活化后的酵母菌液，密封后于30 ℃發酵10 d。

1.2.4 風味分析儀測定

1.2.4.1 樣品處理 將發酵前及發酵后的海帶樣品分別取樣，將海帶片與水以1:2 的比例混合、搗碎，準確稱取0.5 g 搗碎后的樣品放入20 mL 頂空進樣瓶中，加蓋，密封，待測。

1.2.4.2 頂空自動進樣器條件 將密封好的頂空瓶放入頂空自動進樣器，于50 ℃孵化10 min，采用振蕩加熱方式孵化后，進行自動進樣測定。進樣針吸取上層體積為500 μL 的氣體，于60 ℃條件下進樣。

1.2.4.3 GC 條件 設置氣相色譜柱溫度為40 ℃，測定過程中的載氣為高純N2；載氣流速為海帶風味物質分離最適流速：初流速為2 mL/min 保持2 min，后升至10 mL/min 保持3 min，再升至15 mL/min 保持10 min，再升至50 mL/min 保持5 min，最后升至150 mL/min 保持5 min，總分析時間為25 min。

1.2.4.4 IMS 檢測條件 設置IMS 漂移管溫度為45 ℃，測定過程中的漂移氣為高純N2，漂移氣的流速保持150 mL/min 不變；漂移管內的電離源為氘放射，即β射線，離子化模式為正離子模式。

1.3 數據處理

每個樣品平行測定3 次。利用GC-IMS 自帶的LAV 分析軟件對發酵海帶的揮發性風味成分進行采集、指紋圖譜的建立及PCA 分析；通過GC×IMS Library Search 定性軟件內置的NIST 氣相保留指數數據庫和IMS 遷移時間數據庫對采集的VOCs 進行定性分析；利用Origin 軟件對PCA 分析數據進行統計與繪圖。

2 結果與分析

2.1 GC-IMS 譜圖分析

風味分析儀生成的數據是三維譜圖，包括保留時間、遷移時間和峰強度，為便于觀察，取俯視圖進行差異對比。圖1 為海帶發酵前后的GC-IMS 譜圖，橫坐標1.0 處紅線表示反應離子峰（reaction ion peak，RIP）。RIP 峰兩側的每一個點代表一種揮發性有機物，顏色越深表示該化合物的濃度越大[17]。從圖1 中可以看出，發酵后海帶中的風味物質明顯增多；C、D、F、G 樣品中因含有酵母菌，發酵產生乙醇，因此GC-IMS 譜圖RIP 峰右側出現兩條紅線為乙醇峰，由于酵母菌發酵后的樣品中乙醇含量較高，該峰產生拖尾現象。除此之外，海帶發酵前后樣品中的揮發性有機物通過GC-IMS 得到了較好的分離，且可直觀比較不同發酵條件產生的VOCs 間的差異。

圖1 海帶發酵前后的GC-IMS 譜圖Fig.1 GC-IMS spectrum of unfermented and fermented Laminaria japonica

為了更直觀地比較不同條件下所得海帶發酵前后所產生的VOCs 間的差異，對發酵前后的海帶樣品GC-IMS 譜圖中的風味特征峰進行選取，根據VOCs 保留時間及遷移時間對其進行定性分析，通過軟件內置的NIST GC 數據庫及G.A.S 的IMS 數據庫，確定了33 種VOCs，其中濃度較高的物質會產生二聚體。根據VOCs 的CAS 號，可通過網站The Good Scents Company Information System（http://www.thegoodscentscompany.com/）確定其風味描述，以便更好地比較不同發酵條件對海帶VOCs 所產生的影響。

2.2 揮發性風味物質（VOCs）分析

通過GC-IMS 自帶的LAV 軟件建立海帶發酵前后VOCs 的指紋圖譜（圖2），圖譜每一行代表一個樣品中選取的全部信號峰，每一列代表同一揮發性有機物在不同樣品中的信號強度，每個樣品平行測定3 次，顏色越深表示物質含量越高[18]。從指紋圖譜中可以看出每種樣品的完整揮發性有機物信息以及樣品之間揮發性有機物的差異。

圖2 不同條件下發酵海帶的指紋圖譜Fig.2 Fingerprints of fermented Laminaria japonica under the different conditions

由圖2 可知，利用GC-IMS 在發酵海帶樣品可分離出47 個特征峰，定性后得到33 種VOCs，其中13 種VOCs 的含量較高，在分離時不但有單體的存在，還因其高含量產生二聚體，如表1 所示。海帶發酵前后所產生的VOCs 共有7 大類，其中包括10 種醛類化合物、10 種醇類化合物、6 種酮類化合物、2 種羧酸類化合物、3 種酯類化合物、1 種醚類化合物和1 種芳香族化合物。由于烷烴物質的質子親和力低于水，無法捕獲水合質子的氫離子，因此GCIMS 無法檢測烷烴物質。對比指紋圖譜中VOCs 的峰強度，發酵后海帶樣品中VOCs 含量相對發酵前樣品變化顯著，大部分VOCs 在發酵后含量增加，部分化合物在含有酵母菌條件下發酵后含量降低。由圖2 可知，A 區域所示為乳酸菌發酵海帶特征VOCs，而B 區域所示為酵母菌發酵海帶特征VOCs。

由圖2 結合表1 可知，3-辛酮在所有發酵前后海帶樣品中含量基本不變；乙酸乙酯、3-戊酮、2-丁酮、己醛、庚醛、戊醛、戊醇、2-甲基丙醇、2-丙醇這幾種VOCs，在只有乳酸菌發酵后含量基本不變，但在酵母菌發酵后，含量明顯降低；而辛醛、2，3-丁二醇、2-甲基-1-丁醇、正庚醇、2，3-戊二酮這幾種VOCs，在乳酸菌發酵后含量基本不變，但酵母菌發酵后含量明顯升高；乳酸菌發酵后，海帶樣品中反式-2-庚醛、正丁醇、丙酸含量均有所增加；不論是乳酸菌發酵還是酵母菌發酵，海帶樣品中苯甲醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、正己醇、1-辛烯-3-醇、3-戊酮、丁酸、乙二醇二甲醚含量均有所升高；而2-庚酮在只含酵母菌的發酵海帶中含量升高。

表1 發酵海帶揮發性風味物質的定性分析Table 1 Volatile compounds identified in fermented Laminaria japonica

續表 1

據統計，海帶中的醛類含量最高，由GC-IMS 譜圖也可以看出，醛類物質的特征峰顏色較深，表明其含量較高。在發酵前后的海帶樣品中，共確定了10 種醛類物質。發酵后，苯甲醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛含量均有所升高；乳酸菌發酵后，反式-2-庚醛含量升高；而酵母菌發酵后，己醛、庚醛、戊醛含量降低，辛醛含量升高。國內外相關研究表明，己醛和丁醛是黑海褐藻和紅藻中最豐富的的醛類[22]，而三水壇紫菜中己醛含量較高，可產生腥味[23]；醛的鏈長主要影響氣味閾值和氣味特性，低分子量（<150 Da）的醛往往會產生難聞的氣味[19]，而高分子量的醛則具有甜味、水果味[24]；海藻中的短鏈醛（C6～C9）和中鏈醛（C10）是由海藻中的脂肪酸（C20）形成的，而長鏈醛（C15～C17）是由脂肪酸通過形成相應的2-氫過氧酸進而形成的[25]；羰基化合物和醛是造成各種氣味的原因，例如乙醛的堅果味[26]和苯甲醛的杏仁味[27]；直鏈和支鏈醛通常提供青草和刺鼻的風味，而不飽和醛則與蔬菜和魚腥味有關[28]。有研究表明，魚類中五種關鍵化合物，包括己醛、庚醛、壬醛、1-辛烯-3-醇和2,4-庚二烯醛具有腥味[20,,29]。本研究中，低分子量醛如己醛、庚醛和戊醛在酵母菌發酵后含量降低，可能在降低海帶的腥味、提高海帶的風味中起主要作用。

2.3 PCA 分析

主成分分析（principal component analysis，PCA），是一種多元統計方法，是通過正交變換，將一組可能存在相關性的多個變量降維轉換成一組線性不相關的、少數幾項具有代表性的變量，轉換后的變量叫做主成分[30]。當累計貢獻率超過80%時，通常認為基本包含樣品的信息。圖3 表示對選取的GC-IMS 特征峰（峰強）作為其特征變量，進行主成分分析，圖中橫坐標軸PC1 和縱坐標軸PC2 分別表示PCA 分析后各主成分的貢獻率。其中第一主成分（PC1）的貢獻率為66.36%，第二主成分（PC2）的貢獻率為20.23%，前兩個主成分的累計貢獻率為86.58%，說明這兩個主成分基本可以反映出發酵海帶樣品的絕大部分特征。從圖3 可以看出，PCA 可將不同條件下發酵的海帶樣品根據其菌種不同區分開，且相互之間沒有明顯的重疊區域，說明不同發酵條件下的海帶樣品得到了很好的區分。

圖3 不同條件下發酵海帶樣品的主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis of fermented Laminaria japonica under the different conditions

3 結論

本研究首次利用GC-IMS 聯用技術探究發酵海帶的風味變化，無需復雜的前處理及萃取過程，充分利用了GC 高分離效率和IMS 高靈敏度的優勢，將數據以可視化的形式呈現在譜圖中，更直觀地展現出樣品間的差異。根據GC-IMS 數據庫，對分離出的VOCs 進行二維定性，并首次建立了發酵海帶風味物質的指紋圖譜與定性表格。定性結果顯示，發酵海帶樣品中共分離出33 種揮發性物質，包括醛類、醇類、酮類、酯類、醚類和芳香族化合物，以醛類物質為主，其中己醛、庚醛、戊醛等小分子量醛在酵母菌發酵后含量明顯降低；指紋圖譜結果表明，海帶在不同發酵條件下所產生的風味物質差異明顯，因此可根據未知樣品的特征VOCs 類型及其含量判斷發酵菌種；PCA 結果顯示，第一主成分和第二主成分的累計貢獻率可達到86%，表明選取的特征風味峰信息關鍵有效，且不同條件的樣品可得到明顯的區分。GCIMS 分析結果表明，對比分析不同發酵條件樣品的揮發性有機物特征信息用于區分發酵菌種、識別發酵條件的方法是可行的。但由于GC-IMS 技術起步較晚，手段較新，IMS 數據庫不夠完善，部分VOCs無法進行定性，后期可將無法定性的VOCs 用標準物質或其他手段進行驗證，豐富海帶發酵領域的VOCs 數據庫。

本研究通過探究不同菌種發酵過程對海帶風味的影響，表明發酵是降低海帶腥味、改善海帶食品風味的有效加工方式，這為新型發酵海帶產品的開發提供了思路。后期將進一步探索發酵機制，為發酵海帶產品的開發提供更多的理論依據。