南蛇藤提取物對ERK／MAPK通路介導的人胃癌MKN45細胞侵襲轉移的研究*

馬霜，向亮亮，文佩宇，劉延慶

揚州大學醫學院，江蘇 揚州225009

胃癌（gastric cancer，GC）是世界上最致命的惡性腫瘤之一，在眾癌癥中發病率排第五，病死率排第三。除非在早期發現，否則很難通過手術、化療和放療等方法治愈［1］。患者局部復發或遠處轉移，或在腫瘤播散時確診為胃癌，生存期很少超過12個月，5年生存期小于10%［2］。腫瘤細胞的侵襲和轉移是影響胃癌治療的最主要原因之一［3］。因此，抑制胃癌的轉移過程是胃癌治療的重要環節。目前，普遍認為基質金屬蛋白酶［4］（matrix metalloproteinases，MMPs）及上皮間質轉化［5］（epithelial－mesenchymal transitions，EMT）等是包括胃癌在內的多種惡性腫瘤獲得侵襲轉移能力的重要調節因素，已成為抗腫瘤藥物研究的重要方向。南蛇藤為衛矛科南蛇藤屬植物，具有清熱解毒的功效。課題組前期研究發現，南蛇藤乙酸乙酯提取物（celastrus orbiculatus extracts，COE）有顯著的抗腫瘤活性，可抑制多種惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移、血管生成［6－7］及促進凋亡［8］。但COE抑制胃癌MKN45細胞侵襲轉移的研究及內在可能分子機制還未清楚，在國內外未見報道。本研究擬探討COE對人胃癌細胞MKN45侵襲和遷移的影響及其可能的作用機制。

1 材料

1.1 細胞人胃癌MKN45細胞株（中科院上海細胞庫）。

1.2 藥物與試劑南蛇藤（廣州致信藥業有限公司，批號：070510）；5－氟尿嘧啶注射液（5－fluorouracil，5－fu）（上海旭東海普藥業有限公司，批號：170724）。RPMI 1640培養基（Gibco公司，批號：12633012）；胎牛血清（Gibco公司，批號：10099－141）；胰酶細胞消化液（碧云天公司，批號：C0201）；MTT粉劑（美國Sigma公司，批號：M2128）；Matrigel膠（北京索萊寶科技有限公司，批號：M8370）；MMP－2、MMP－9、EMT、Ras、Raf、MEK、ERK、β－actin（美國CST公司，貨號分別為：4022S、3852S、9782S、3339S、9422S、4694S、4695S、4970S）；增強型化學發光試劑盒（英國Amersham Life Science公司，貨號：RPN2232）。

1.3 儀器Heracell 150i型CO2培養箱（美國Thermo公司）；MSC1.2型生物安全柜（美國Thermo公司）；EnSpire型多功能酶標儀（美國PerkinElmer公司）；電泳槽、凝膠成像分析儀（美國Bio－Rad公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 藥物的制備南蛇藤由秦民堅教授（中國藥科大學中藥資源研究室）鑒定，后由王強教授課題組（中國藥科大學）完成對南蛇藤的提取、純化和鑒定［9－10］。將南蛇藤莖充分粉碎后，經95%乙醇加熱回流提取3次，回收溶劑得到浸膏后用硅藻土拌勻，再進行真空低溫抽干，用乙酸乙酯熱水浴回流加熱、過濾，即得到南蛇藤乙酸乙酯提取物（COE），其中，萜類化合物含量約為68%［11］。該制備法已取國家發明專利（專利號：ZL200710025343.3）。

2.2 MTT比色法檢測細胞增殖取對數生長期的MKN45細胞用胰酶消化，收集單細胞懸液，計數后調整濃度為每孔約5×104個，接種于96孔板。待細胞貼壁生長后換入無血清培養基配制的COE（20 mg·L－1、40 mg·L－1、80 mg·L－1、160 mg·L－1、320 mg·L－1）200μL，繼續孵育24 h、48 h、72 h后，分別加入0.5%MTT溶液繼續培養4 h，棄上清，每孔中加150μL DMSO溶劑，置酶標儀內低速振蕩10 min，充分溶解后在490 nm處檢測各孔吸光度值。每組設5個復孔，重復3次。

2.3 劃痕實驗細胞制備同上，均勻接種于6孔板中。待細胞貼壁并生長良好后，用槍頭在每孔中輕輕刮出2 mm左右刮痕，無菌PBS沖洗劃痕中部漂浮細胞，置倒置顯微鏡下確認刮痕內無細胞后拍照。設立 對 照組、COE（20 mg·L－1、40 mg·L－1、80 mg·L－1）組、5－fu組。繼續培養24 h后，于倒置顯微鏡下觀察拍照，記錄各孔中劃痕距離。每組設3個復孔。

2.4 細胞侵襲實驗Matrigel膠用培養基按1∶6稀釋后，均勻鋪在Transwell小室的上室底部孵育待用。設對照組、COE組（20 mg·L－1、40 mg·L－1、80 mg·L－1）、5－fu組，培養24 h后，將各組細胞消化，用無血清RPMI 1640培養基制成濃度為每1 mL含5×105個細胞。在Transwell的上室加入200μL各組單細胞懸液，下室加入500μL含20%FBS的RPMI 1640培養基，繼續培養24 h后，取出Transwell小室用無菌PBS清洗3次，用棉簽拭去上室膜表面的細胞后，甲醇固定20 min，0.1%結晶紫常溫下染色20 min，再洗脫結晶紫。每組設置3個復孔。倒置顯微鏡下計數中間和四周5個視野侵襲的細胞數目，取平均值。

2.5 細胞遷移實驗除了Transwell小室上室底面不用Matrigel膠稀釋包被外，其余步驟均同2.4。

2.6 Western Blot法檢測蛋白的表達取對數期細胞，分組同上，經不同藥物處理24 h后，提取總蛋白，并進行濃度定量分析，電泳、轉膜、封閉、抗體孵育，一抗濃度設為1∶1 000，二抗濃度為1∶2 000，ECL發光，采集并分析圖像。

2.7 統計學方法采用SPSS 20.0軟件統計分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 CEO對MKN45細胞增殖的影響采用MTT法探討不同濃度的COE（10 mg·L－1、20 mg·L－1、40 mg·L－1、80 mg·L－1、160 mg·L－1、320 mg·L－1）作用后對MKN45細胞增殖能力的影響。藥物作用24 h、48 h、72 h后，細胞生長呈現出不同程度的增殖抑制，且呈濃度及時間依賴性。在藥物作用24 h條件下，計算CEO對MKN45細胞作用的半數抑制濃度（IC50）為129.5 mg·L－1。為排除COE對細胞的毒性作用影響，后續實驗中COE質量濃度設置為20 mg·L－1、40 mg·L－1、80 mg·L－1遠低于IC50的濃度，時間設置為24 h。見表1。

表1 CEO對MKN45細胞增殖的影響 （±s，n＝5）

表1 CEO對MKN45細胞增殖的影響 （±s，n＝5）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

組別濃度（ρ／mg·L－1）細胞增值率／%24 h 48 h 72 h對照組100 100 100 COE組 10 94.56±5.68 81.99±5.74 73.06±4.58 20 85.61±3.11* 73.41±3.87* 52.59±2.49*40 74.90±1.92* 65.13±9.66** 39.05±5.41**80 56.22±4.33** 55.94±6.54** 23.64±4.65**160 29.71±7.55***18.79±5.66** 15.80±5.36**320 20.41±4.39***12.42±8.41*** 9.86±7.29－**

3.2 CEO對MKN45細胞遷移能力經不同濃度COE處理24 h后，觀察細胞往劃痕中心遷移的距離。與對照組相比，濃度越高的COE處理24 h后，遷移的距離越小，提示遷移速率變慢，表明CEO可顯著抑制MKN45細胞的遷移。見圖1，表2。

表2 各組細胞遷移距離 （±s，n＝3）

表2 各組細胞遷移距離 （±s，n＝3）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 濃度（ρ／mg·L－1）遷移距離對照組－0.53±0.11**COE組 20 0.31±0.05**40 0.18±0.03*80 0.05±0.02 5－fu組32 0.04±0.01

3.3 CEO對MKN45細胞侵襲與遷移能力的影響

與對照組相比，經COE干預后，侵襲細胞數量和遷移細胞數量明顯減少（P＜0.05），且與藥物濃度呈相關性。即COE可顯著抑制MKN45細胞的侵襲和遷移。見表3，圖2。

表3 各組Transwell小室穿膜細胞數目 （±s，n＝5）

表3 各組Transwell小室穿膜細胞數目 （±s，n＝5）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

組別 濃度（ρ／mg·L－1）侵襲細胞數目 遷移細胞數目對照組－ 183.4±24.6 204.8±18.6 COE組 20 165.9±22.8 185.2±21.7 40 104.8±15.2** 114.8±24.3*80 49.6±11.8*** 51.7±12.9***5－fu組 32 59.6±9.1*** 66.9±9.7***

3.4 CEO對MKN45細胞中MMP2、MMP9及EMT相關蛋白表達的影響與對照組比較，隨著CEO濃度的增加，細胞中MMP－2、MMP－9、Ncadherin、Vimentin蛋白表達降低（P＜0.05），Ecadherin蛋白表達升高（P＜0.05）。即COE可下調胃癌MKN45細胞中MMP－2、MMP－9、N－cadherin、Vimention蛋白表達，上調E－cadherin蛋白表達。見圖3。

圖1 CEO對MKN45細胞遷移能力的影響（×200）

圖2 CEO對MKN45細胞侵襲與遷移的影響（×200）

3.5 CEO對MKN45細胞中ERK／MAPK信號通路相關蛋白表達的影響與對照組比較，隨著CEO濃度的增加，細胞中Ras、Raf、MEK及ERK1／2蛋白表達降低（P＜0.05）。即COE可通過抑制ERK／MAPK信號通路來抑制胃癌細胞的侵襲轉移。見圖4。

圖3 CEO對MKN45細胞MMP2、MMP9及EMT蛋白表達的影響

圖4 CEO對MKN45細胞中ERK／MAPK信號通路相關蛋白表達的影響

4 討論

胃癌是一種高度異質性的疾病，即使在臨床和病理特征相似的患者中，其結果也可能存在較大差異。腫瘤的復發和轉移是影響生存率的主要因素之一。上皮間質轉化［12］、相關信號通路激活［13］等已被公認為腫瘤復發和轉移的關鍵因素。研究發現，中藥在防治癌前病變、抑制胃癌的侵襲和轉移、改善化療不良反應等方面有良好的作用［14－17］。

惡性腫瘤細胞侵襲與轉移的重要原因之一是腫瘤微環境中的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的降解和基底膜（basement membrane，BM）的破壞［18］。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在許多生物過程中具有重要作用，包括細胞增殖、遷移和分化、血管生成及ECM重塑等。在腫瘤微環境中，MMPs以酶原形式分泌，在各種蛋白酶作用下裂解為活性形式，激活后形成的明膠酶類MMPs可降解腫瘤細胞ECM的主要成分，使腫瘤細胞沿缺失的BM向周圍組織浸潤［19－20］。MMP2、MMP9是MMPs家族中兩個重要組成因子，已有研究表明，其與胃癌的侵襲、轉移關系密切［21］。EMT是上皮細胞上皮樣特征減少并獲得間充質細胞特性的生理過程，是腫瘤細胞侵襲轉移所必要的初始步驟［22－23］。E－cadherin是上皮細胞的標志分子，Ncadherin和Vimentin是間質細胞的標志分子，它們共同作用下，可減少細胞間黏附、增加細胞的轉移［24］。MMPs與EMT的關系密切，MMPs是間質細胞的標志性蛋白之一，是EMT發生的標志，當細胞微環境中MMPs表達異常時可誘導EMT的發生［25－26］。ERK／MAPK信號通路在控制細胞的生長、發育、分裂和死亡等各種生理過程中起重要的作用，是調控細胞生長、發育和分裂的信號網絡核心［27］。有研究表明，ERK在人多種腫瘤細胞中高表達，如乳腺癌、胃癌、腸癌等，說明ERK／MAPK信號通路在腫瘤的侵襲轉移中起重要作用［28－29］。

本研究通過劃痕實驗及細胞遷移實驗驗證了COE可顯著抑制胃癌細胞侵襲與轉移的作用。Western Blot結果顯示，CEO可下調MMP2和MMP9蛋白表達，從而降低人胃癌MKN45細胞侵襲和轉移能力，同時也可上調E－cadherin、下調N－cadherin、Vimentin蛋白表達，進而抑制胃癌細胞的侵襲轉移。提示COE可抑制ERK／MAPK信號通路來抑制人胃癌細胞的侵襲與轉移。

綜上，本研究表明COE可抑制胃癌MKN45細胞侵襲與轉移，其作用機制可能與直接下調MMP2和MMP9蛋白，激活ERK／MAPK信號通路有關。本實驗揭示了COE抗胃癌侵襲、轉移的可能作用機制，為抗胃癌轉移的新中藥開發提供了理論依據。但是，目前還沒有充分的研究，故需要進行體內實驗進一步論證。