益氣活血方對肝纖維化大鼠JNK通路的作用研究*

石家莊市中醫院脾胃科

孟 萍 南月敏△(石家莊 050051)

提要 目的：研究c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號轉導通路在CCl4誘導的肝纖維化大鼠模型中的表達，以闡明益氣活血方抑制肝纖維化的分子機制。方法：27只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組和益氣活血方治療組。模型組以30%CCl4 橄欖油溶液腹腔注射誘導建立肝纖維化模型；益氣活血方治療組在CCl4 建模的同時以益氣活血方灌胃進行干預實驗；對照組腹腔注射橄欖油溶液。檢測大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)及天冬氨酸氨基轉移酶(AST)水平；分別采用RT-PCR及Western Blot法檢測大鼠肝組織JNK信號通路中JNK、c-Jun mRNA表達及其磷酸化產物p-JNK、p-c-Jun蛋白表達。結果：模型組大鼠血清ALT、AST水平、肝組織JNK、c-Jun mRNA及p-JNK、p-c-Jun蛋白表達增高，與對照組相比差異有顯著性，而益氣活血方治療組可顯著降低ALT、AST、c-Jun mRNA及p-JNK、p-c-Jun蛋白表達水平(P均<0.05)。結論：益氣活血方通過抑制JNK信號轉導通路的活化，從而延緩肝纖維化進展。

肝纖維化是肌體對慢性損傷的主動修復反應，以細胞外基質(ECM)異常沉積為特征。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是絲裂原活化蛋白激酶家族的重要成員，研究證實，JNK信號通路在肝纖維化發生發展中發揮重要作用[1]。筆者的前期研究發現[2-4]，益氣活血方可調節肝細胞自噬，抑制肝星狀細胞(HSC)活化及ECM沉積，促進膠原降解，并能抑制死亡受體途徑FasL/Fas的激活，上調線粒體途徑Bcl-2/Bax比例，抑制細胞凋亡，發揮阻止及延緩肝纖維化的作用，但其對JNK信號轉導通路的影響尚不十分清楚。筆者以CCl4建立大鼠肝纖維化模型，并應用益氣活血方進行治療研究，觀察JNK信號通路因子的表達變化，為益氣活血方在臨床應用于抗肝纖維化的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立 清潔級雄性Wistar大鼠27只，體質量180～220 g，來源于河北醫科大學實驗動物中心。隨機分為3組：對照組9只，腹腔注射橄欖油(0.2 mL/100 g)，2次/周，并以生理鹽水灌胃(1 mL/100 g)，1次/d；模型組9只，腹腔注射30%CCl4橄欖油溶液，同樣以生理鹽水灌胃；益氣活血方治療組9只，腹腔注射30%CCl4橄欖油溶液，以自擬益氣活血方(黃芪、丹參、云茯苓、白豆蔻、郁金等)免煎顆粒劑溶液(免煎顆粒由江蘇省江陰天江藥業有限公司提供)灌胃。喂養8周后深度麻醉下處死大鼠，留取血清，備行肝臟生化檢測；剖腹取肝臟，用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存，用于提取mRNA及蛋白。

1.2 肝功能指標檢測 應用邁瑞BS-800M全自動生化分析儀檢測大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(AST)。

1.3 肝組織JNK通路因子JNK、c-jun mRNA表達 采用實時定量RT-PCR法。Trizol一步法提取肝組織總RNA，逆轉錄合成cDNA。以適量cDNA為模板，GAPDH為內參照，進行實時定量擴增。每個基因重復操作3次，運用2-△△CT法分析結果。依據Genbank設計引物序列，由上海生物工程公司合成，具體序列詳見表1。

表1

1.4 肝組織JNK通路因子JNK、p-JNK、p-c-Jun蛋白表達 取肝組織20 mg，提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性后，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別與兔抗GAPDH(美國Affinity公司)、兔抗JNK、p-JNK、p-c-Jun抗體(英國Abcam公司)反應，4 ℃孵育過夜。洗滌后加入第二抗體，室溫孵育1 h再洗膜。使用化學發光試劑檢測，X光片顯影。應用Quantity One軟件分析目的蛋白條帶灰度值，所測結果為扣除背景的積分光密度。

2 結果

2.1 益氣活血方對大鼠血清ALT、AST水平的影響 如表2所示，模型組大鼠血清ALT、AST水平均較對照組顯著增高(P均<0.001)；益氣活血方治療組大鼠血清ALT、AST水平均明顯低于模型組(P均<0.001)，差異具有非常顯著性。

表2 實驗大鼠血清ALT、AST水平變化

2.2 益氣活血方對大鼠肝組織JNK信號通路JNK、c-Jun mRNA表達水平的影響 如表3所示，與對照組相比，模型組大鼠肝組織JNK和c-Jun mRNA表達水平顯著增加(P分別<0.05，<0.01)；而益氣活血方組c-Jun mRNA水平較模型組明顯下降(P<0.05)，JNK mRNA 2組間無明顯差異(P>0.05)。

表3 實驗大鼠肝組織mRNA表達變化

2.3 益氣活血方對大鼠肝組織JNK信號通路JNK、p-JNK、p-c-Jun蛋白表達水平的影響 如圖1、表4所示，同對照組相比，模型組大鼠肝組織p-JNK和p-c-Jun蛋白表達水平顯著增加(P均<0.001)；而益氣活血方組p-JNK、p-c-Jun蛋白水平較模型組明顯下降(P均<0.001)。各組JNK蛋白表達水平差異無顯著性(P>0.05)。

圖1 實驗大鼠肝組織JNK、p-JNK、p-c-Jun蛋白表達變化

表4 實驗大鼠肝組織蛋白表達變化

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化發展的中間病理階段，伴隨ECM合成增多、降解減少致ECM大量堆積，而HSC是肝纖維組織中ECM的主要來源[5]。肝纖維化若不及時治療，將進一步轉化為肝硬化甚至肝癌，嚴重降低患者的生活質量甚至威脅生命。因此，肝纖維化成為預防和治療肝硬化以及肝癌發生的關鍵點。

本研究中，CCl4誘導的模型組大鼠血清ALT及AST水平顯著增高。當肌體攝入一定量的CCl4，產生大量的親電子基、自由基等活性代謝物，引起膜脂質過氧化，損傷肝細胞，導致細胞質內ALT和AST釋放入血液[6]。而應用自擬益氣活血方干預， ALT及AST水平顯著降低，表明益氣活血方減輕了CCl4對肝臟的損傷，具有保肝、抗肝損傷的作用。益氣活血方中：⑴黃芪具補氣扶正、固表利水之效，可改善肝組織的氧化應激及脂質過氧化損傷的程度，抑制肝細胞凋亡，可有效抗肝損傷[7]；⑵云茯苓和胃健脾、利水滲濕，可改善肝臟的微循環，抑制ECM的合成[8]；⑶郁金具有活血行氣、涼血解郁、利膽退黃的功效，可降低HSC的膠原蛋白分泌功能，誘導HSC發生細胞凋亡[9-10]；⑷丹參和白豆蔻活血化瘀、溫中行氣、化濕健脾，可下調肝組織轉化生長因子β表達，抑制ECM合成，起到延緩肝纖維化的作用[11-12]。

JNK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可由3個基因編碼，分別為JNK1、JNK2及JNK3，可轉導細胞外刺激信號致細胞內，多途徑、多靶點調控包括炎癥反應、細胞分化、增殖、凋亡、應激反應等生理活動[13]。c-Jun蛋白是JNK蛋白激酶的重要底物，活化的JNK可進一步激活c-Jun，調控相關基因轉錄，發揮生物學作用[14]。本研究從mRNA及蛋白表達角度顯示，模型組大鼠肝組織JNK、c-Jun mRNA及p-JNK、p-c-Jun蛋白表達較對照組顯著增加，提示JNK活化，并激活c-Jun，可作為肝纖維化發生發展的重要機制之一；而應用益氣活血方能顯著抑制c-Jun mRNA及p-JNK、p-c-Jun蛋白表達的上調，提示益氣活血方能抑制JNK及其下游c-Jun的激活，進而延緩或阻止肝纖維化。研究證實，多種細胞因子可通過JNK信號通路激活HSC[15]，促進肝纖維化的進展，應用JNK特異阻斷劑可抑制HSC增殖[16]，有效抗肝纖維化。與作者的結果相同，中藥芝麻素可抑制受損肝細胞JNK的表達，進而抑制轉錄因子c-Jun磷酸化，阻止CCl4誘導的肝細胞損傷[17]。同時，呂曉梅等[18]證實CCl4致大鼠急性肝損傷模型中，模型組大鼠肝臟中p-JNK和p-c-Jun蛋白表達水平顯著增加。然而，李政通等[19]發現，p-JNK1/2蛋白在肝纖維化模型組較正常組顯著降低，而在肝纖維化逆轉期表達增加，且p-JNK的含量與膠原蛋白主要組分羥脯氨酸(Hyp)的表達負相關，說明p-JNK與肝纖維化病變程度呈負相關性，與作者的結果相反，需要進行進一步研究予以證實。

研究證實，肝損傷與JNK信號轉導通路的活化密切相關，且常伴隨肝細胞凋亡的發生[20]?；罨腏NK可能通過以下機制介導細胞凋亡，從而促進肝纖維化進展。(1)死亡受體途徑：激活下游c-Jun、c-Fos樣轉錄因子等，上調促凋亡蛋白P53、FasL等的表達，促進細胞凋亡[21]；(2)線粒體途徑：上調促凋亡蛋白Bax表達，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的活性，作用于線粒體促進細胞色素C釋放，從而激活胱天蛋白酶，誘導細胞凋亡[22]。

綜上分析，結合課題組前期研究結果，抑制FasL/Fas系統的激活，上調抗凋亡蛋白Bcl-2/下調促凋亡蛋白Bax表達，降低JNK及其下游c-jun的表達，調控JNK信號轉導通路從而減少肝細胞凋亡，可能是益氣活血方減輕CCl4模型大鼠肝細胞損傷、延緩肝纖維化進展的部分作用機制。