分析實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌的臨床應(yīng)用價(jià)值

劉梅，楊芳

濟(jì)寧市公共衛(wèi)生醫(yī)療中心檢驗(yàn)科，山東濟(jì)寧 272100

結(jié)核病是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域較難解決的一個(gè)問(wèn)題， 且是一項(xiàng)全球性問(wèn)題。 就目前的形式來(lái)看，該疾病的發(fā)生率逐年上升。 根據(jù)相關(guān)報(bào)道[1]全球范圍內(nèi)約有2 000 的結(jié)核病患者，除此之外，每年會(huì)大約出現(xiàn)900 萬(wàn)的患者，而這些患者中， 每年會(huì)有將近340 萬(wàn)患者因?yàn)榻Y(jié)核病死亡，病死率較高，給全球人類均帶來(lái)較大的影響。 結(jié)核病不論是在我國(guó)還是其他國(guó)家都是一個(gè)醫(yī)學(xué)熱點(diǎn)問(wèn)題， 許多國(guó)家都將醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)放在了結(jié)核病的預(yù)防和控制[2]。 要想有效預(yù)防結(jié)核病，就必須要及時(shí)并正確的診斷結(jié)核病， 目前臨床對(duì)于結(jié)核病的確診通常是涂片法與培養(yǎng)法，但這兩種方法均存在著不同的弊端，必須另尋可靠的方法， 才能做好結(jié)核病的控制與預(yù)防[3]。該文隨機(jī)選取2018 年 2 月—2019 年 2 月收治的 100例患者分析應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)對(duì)結(jié)核桿菌的診斷作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從該院收治的結(jié)核病患者中隨機(jī)抽取100 例，其中男性 56 例， 女性 44 例； 年齡 20~61 歲， 平均年齡（43.26±4.05）歲；發(fā)病時(shí)間 2 個(gè)月~16 年，平均發(fā)病時(shí)間為（8.21±2.33）年。 所有患者均經(jīng)由該院相關(guān)醫(yī)學(xué)檢查確診為結(jié)核病患者， 患者的臨床表現(xiàn)多為咳嗽、 咳痰等，部分患者會(huì)伴隨氣急、胸悶等臨床癥狀。 研究得到醫(yī)院倫理會(huì)批準(zhǔn)和認(rèn)可。 納入標(biāo)準(zhǔn)：患者在知情的基礎(chǔ)上自愿簽署相關(guān)協(xié)議。 排除標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)我换蚨嗥鞴俟δ芩ソ撸淮嬖趪?yán)重疾病者。

1.2 方法

標(biāo)本采集：對(duì)所有患者進(jìn)行標(biāo)本采集，肺結(jié)核患者在早晨晨起體檢時(shí)利用清水與30 mL 雙氧水漱口，用力深咳，第一口痰吐于垃圾簍，收集患者第二口痰置于器皿中，送至檢驗(yàn)科檢測(cè)。 所有患者的痰標(biāo)本均根據(jù)相關(guān)規(guī)程嚴(yán)格操作，應(yīng)用涂片抗酸染色與結(jié)核菌培養(yǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室研究診斷。 抗酸染色法步驟：使用石碳酸復(fù)紅滴入2~3 滴到涂片標(biāo)本當(dāng)中， 避免沸騰的情況下在火焰高處加熱，出現(xiàn)蒸汽即離開，根據(jù)染液的減少情況適當(dāng)增加，標(biāo)本冷卻后用水沖洗；利用3%鹽酸酒精進(jìn)行脫色，后用水沖洗；使用堿性美藍(lán)溶液復(fù)染1 min，用水沖洗，并使用吸水紙將水分吸干，使用油鏡觀察。 將標(biāo)本與化驗(yàn)單均根據(jù)相應(yīng)的程序在樣本接受處進(jìn)行編號(hào)，并嚴(yán)格根據(jù)相應(yīng)的程序操作。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)（儀器編碼MX3000P），根據(jù)《全國(guó)結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》當(dāng)中的有關(guān)規(guī)定挑取痰液部分， 通過(guò)鏡檢后找到結(jié)核分枝桿菌判定為陽(yáng)性，無(wú)結(jié)核分枝桿菌則為陰性。

痰液標(biāo)本處理： 在痰液標(biāo)本當(dāng)中加入4 倍體積的4%氫氧化鈉（NaOH），并將其搖晃均勻，在室溫的環(huán)境下靜置30 min 使其液化后，取出1 mL 的液體，將其離心。 離心速率設(shè)定在15 000 r/min，離心時(shí)間為5 min，離心后取出上清液，經(jīng)過(guò)2 次的沉淀后加入1 mL 的無(wú)菌生理鹽水，并蓋緊混勻。 同時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)主要是提取DNA；該實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用全自動(dòng)PCE 基因擴(kuò)增儀， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序相關(guān)規(guī)定進(jìn)入擴(kuò)增分析區(qū)，將擴(kuò)增儀與電腦開啟后進(jìn)入系統(tǒng)，預(yù)熱擴(kuò)增儀的燈泡，然后按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行下一步操作，電腦會(huì)自動(dòng)生成相應(yīng)的監(jiān)測(cè)報(bào)告。 經(jīng)25 μL 的反應(yīng)體系反應(yīng)結(jié)束后，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值（Ct），檢測(cè)方式為陽(yáng)性梯度，如果Ct≤37 則為陽(yáng)性，等于40 則為陰性，Ct在38~40 為可疑樣本，針對(duì)可疑樣本需要進(jìn)行復(fù)檢；經(jīng)復(fù)檢后Ct 無(wú)數(shù)值判定為陰性，否則為陽(yáng)性。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)所有患者應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)、 培養(yǎng)法與涂片法進(jìn)行結(jié)核桿菌檢測(cè)， 根據(jù)得出的數(shù)據(jù)分析所有患者的陽(yáng)性率，并對(duì)其進(jìn)行對(duì)比。 陽(yáng)性率=陽(yáng)性例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件予以數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分比(%)表示，組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)、培養(yǎng)法、涂片法檢測(cè)患者的結(jié)核標(biāo)本的陽(yáng)性率分別為53%、32%、27%，實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)的陽(yáng)性率明顯高于培養(yǎng)法與涂片法， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.023、14.083，P＜0.05）。 見(jiàn)表 1。

表1 3 種方式檢測(cè)陽(yáng)性率對(duì)比

3 討論

肺結(jié)核屬于一種慢性傳染病， 其特征為細(xì)胞免疫力低下，是由結(jié)核桿菌引起的，患病后對(duì)患者全身器官均有一定影響，從全球范圍來(lái)看，約有1/3 的人感染結(jié)核桿菌[4-5]。 對(duì)于結(jié)核病的治療原則是早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)、及時(shí)診斷以及及時(shí)治療， 通過(guò)這一方法可以有效控制肺結(jié)核感染情況，改善預(yù)后，對(duì)患者的生活質(zhì)量也有一定的優(yōu)化作用[6]。

目前臨床針對(duì)肺結(jié)核疾病最準(zhǔn)確的診斷方式就是結(jié)核菌分離培養(yǎng)方法， 但傳統(tǒng)的培養(yǎng)法與涂片法檢測(cè)效率并不高， 往往需要許多的工作人員共同進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)檢測(cè)，消耗時(shí)間較長(zhǎng)，在一定程度上影響了肺結(jié)核的檢測(cè)速度，且檢測(cè)的陽(yáng)性率較低，不能準(zhǔn)確地檢測(cè)出患者體內(nèi)的結(jié)核桿菌[7]。 為了克服傳統(tǒng)涂片法與培養(yǎng)法的問(wèn)題與弊端， 近年來(lái)隨著醫(yī)療服務(wù)行業(yè)的不斷進(jìn)步，實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)一經(jīng)出現(xiàn)就立刻試用于臨床， 并在臨床得到快速的發(fā)展，尤其是對(duì)肺結(jié)核患者的結(jié)核桿菌進(jìn)行檢測(cè)[8]。

實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)結(jié)核桿菌中， 相比涂片法與培養(yǎng)法，具有更高的敏感度和特異性，即便是含有結(jié)核桿菌較少的標(biāo)本， 如患者的尿液以及胸腹水等， 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)也能有效檢測(cè)出結(jié)核桿菌的存在，能夠極大提升結(jié)核桿菌的檢出率，提升檢測(cè)效率[9]。 這一優(yōu)勢(shì)有助于醫(yī)院及時(shí)對(duì)結(jié)核病患者進(jìn)行有效干預(yù)，從而對(duì)患者進(jìn)行有針對(duì)性的預(yù)防和控制。 在該次實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，同時(shí)對(duì)100 例結(jié)核病患者行涂片法、培養(yǎng)法與實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)檢測(cè)法， 結(jié)果顯示應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)檢測(cè)法的檢測(cè)陽(yáng)性率均明顯高于涂片法和培養(yǎng)法[10]。

實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)通過(guò)加入一條與靶基因序列互補(bǔ)的熒光雙標(biāo)記寡核苷酸探針，當(dāng)患者的標(biāo)本中出現(xiàn)特異性PCR 擴(kuò)增的情況，則會(huì)出現(xiàn)特異性的熒光，根據(jù)熒光值的變化，能有效且準(zhǔn)確的判定擴(kuò)增產(chǎn)物的量[11-13]。但實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)的使用也受到一定的限制， 究其原因在于結(jié)核菌難能破壁以及樣本當(dāng)中存在著各種各樣的抑制物，會(huì)導(dǎo)致其出現(xiàn)假陰性[14-16]。 如果在檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果， 則首先要考慮標(biāo)本是否受到污染， 也可以進(jìn)一步分析是否擴(kuò)增了患者體內(nèi)潛伏的分枝桿菌。 如果患者體內(nèi)有惡性腫瘤，則免疫抑制特性就會(huì)導(dǎo)致患者的結(jié)核病復(fù)發(fā)， 如果患者體內(nèi)腫瘤壞死，則會(huì)將潛伏的結(jié)核分枝桿菌釋放出來(lái)，將陰性轉(zhuǎn)變?yōu)殛?yáng)性[17-19]。

該次研究結(jié)果表明，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)、培養(yǎng)法、涂片法檢測(cè)患者的結(jié)核標(biāo)本的陽(yáng)性率分別為53%、32%、27%，實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)的陽(yáng)性率明顯高于培養(yǎng)法與涂片法。該文的研究結(jié)果與譚珂等[14]人的研究結(jié)論一致， 即應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)顯示出的陽(yáng)性數(shù)量明顯高于涂片法與培養(yǎng)法的檢測(cè)方式， 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)檢測(cè)患者的結(jié)核標(biāo)本陽(yáng)性率為56%， 培養(yǎng)法的陽(yáng)性率為33%，涂片法的陽(yáng)性率為26%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。 說(shuō)明，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)處理對(duì)結(jié)核桿菌DNA 具有更高的敏感性，檢出率也更高。

綜上所述， 實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核桿菌的檢測(cè)中具有較為明顯的優(yōu)勢(shì)，且檢出率也較高，有更高的應(yīng)用價(jià)值。