肺鱗癌患者死亡相關蛋白激酶表達及其啟動子甲基化水平的診療意義

石珊珊 劉麗潔 張秀娣 王曉杰 劉楠楠 尹小波 田祺 徐淑鳳

(秦皇島市第一醫院，河北 秦皇島 066000)

隨著城市大氣污染逐漸加重及其他各類致癌物質不斷增加，肺鱗狀細胞癌的發病率也隨之升高〔1〕。死亡相關蛋白激酶(DAPK)是人體細胞中存在的抑癌因子之一，參與調節人類細胞的內源性及外源性的凋亡途徑，DAPK基因啟動子甲基化與多種惡性腫瘤的發生、發展有密切關系〔2〕。研究結果表明，4%的組織特異性基因和所有的管家基因的5′端調控區都存在一個胞嘧啶磷酸鳥嘌呤(CpG)高頻區，稱為CpG島〔3〕。依據肺癌所具有的病理組織學特點可將其劃分為兩大類型即小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)，在臨床中80%～85%的肺癌患者的病理類型是NSCLC。目前研究遺傳學機制在NSCLC發生發展中的作用日益受到重視，尤其是T-鈣黏蛋白(CDH13)基因啟動子區的高甲基化狀態與該基因轉錄過程受抑制失活在肺癌發生發展中的作用機制〔4〕。抑癌基因的5′端CpG島甲基化在NSCLC發生、發展的過程中發生比較頻繁，并且這種異常的甲基化狀態在肺癌發生的早期就能被檢測到。研究結果顯示，基因啟動子的CpG島發生甲基化改變是引起基因失活特別是抑癌基因失活的關鍵因素之一，因此啟動子甲基化改變在NSCLC發生發展過程中所發揮的作用也引起了廣泛的關注〔5〕。本研究探討吸煙肺鱗癌患者痰液及血清中DAPK表達及啟動子甲基化在臨床診療中的意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取秦皇島第一醫院的肺鱗癌患者60例為實驗組，平均年齡(61.0±5.1)歲，同期健康人群34例為對照組，并均排除家族惡性腫瘤史，其中男20例，女14例，平均年齡(60.0±1.2)歲。兩組均留取其痰液及血清標本。兩組性別、年齡等一般資料無統計學差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2主要儀器及試劑 低溫離心機(美國Beckman公司)，恒溫水箱(上海啟前公司)，水平凝膠電泳系統(英國Cleayer公司)，紫外分光光度計(上海光譜公司)，聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀(北京東勝)，紫外熒光數字成像儀(德國孚光公司)，電子分析天平(日本島津公司)。兔抗人DAPK多克隆抗體(武漢博士德公司)，兔抗人血管內皮生長因子(VEGF)多克隆抗體(北京中杉金橋)，2×Taq PCR MasterMix試劑盒(南京賽泓瑞公司)。采用引物為上海生工生物工程技術服務有限公司完成，β-actin上游：5′-GGGACCTGACTGACCTCA-3′，下游：5′-GGTGGAATCCC TCCGACA-3′;DAPK上游：5′-GGATATGGGATTTTTGTGTAGATTAGTA-3′，下游：5′-ACCAAAATAATCTCCATCTCTTAAC-3′。

1.3痰液和血清脫氧核糖核酸(DNA)提取及甲基化檢測 試劑盒提取血清中DNA，血清中DNA甲基化檢測參照Hennan方法(MSP)。β-actin作為空白對照，健康人群DNA作為未甲基化分析的對照組。痰液留取及啟動子甲基化檢測，患者入院后留取清晨口腔清潔后深咳痰液，置于Saccomanno液中，放置3 d。痰液中DNA的提取方法：4 000 r/min 4℃離心15 min后，將沉淀用DNA提取液〔10 mmol/L Tris·HCl；0.1 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，20 μg/ml核糖核酸(RNA)酶，0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)〕移入1.5 ml離心管，混勻后37℃水浴1 h。以后步驟同血清標本DNA提取及甲基化檢測。對擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠(內含EB)電泳(120 V，30 min)，內參照為β-actin。應用紫外線透視儀對相應擴增條帶進行光密度值(IOD)測定。

1.4血清及痰液免疫組化 將采集后的血液及痰液進行標本處理，按常規免疫組化步驟行染色處理，DAPK表達以細胞質出現棕褐色顆粒為陽性表達，隨機選取5個高倍視野(×400)，①按照高倍視野下所見組織著色程度(A值)進行評分：無著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。②按照高倍視野下所見陽性細胞百分率(B值)進行評分：陽性細胞小于25%為1分，陽性細胞在25%～50%之間為2分，陽性細胞>50%為3分；③將A值、B值相加對結果進行判斷：陰性(-)：0分，弱陽性(+)：1～3分，強陽性()：4～6分。

1.5統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行χ2檢驗。

2 結 果

2.1兩組痰液及血清中DAPK蛋白表達 實驗組痰液〔50.00%(+8例、15例、7例)〕及血清中DAPK蛋白表達陽性率〔60.00%(+8例、20例、8例〕均顯著低于對照組〔91.18%(+4例、9例、8例)；91.18%(+2例、25例、48例)，χ2=16.151,10.303;均P<0.05〕。

2.2兩組痰液及血清中DAPK啟動子甲基化率 實驗組痰液及血清中DAPK啟動子甲基化率〔37例(61.67%)、40例(66.67%)〕均顯著高于對照組〔0例(0.00%)、0例(0.00%)，均P<0.05〕。

2.3DAPK 在肺鱗癌患者痰液及血清中的表達 DAPK在痰液和血清中表達量與年齡、性別、腫瘤大小及腫瘤分化程度無關(P>0.05)，與腫瘤浸潤及淋巴結轉移有關(P<0.05)，見表1。

表1 DAPK 在肺鱗癌患者痰液及血清中的表達〔n(%)〕

3 討 論

多項研究結果表明，基因啟動子區域CpG島異常甲基化的發生和基因轉錄抑制失活緊密相關。在多種惡性腫瘤發生的早期過程中，基因啟動子異常甲基化是一個頻繁發作的事件，因此研究者考慮它可作為一種有實際應用可能的腫瘤分子生物標志物〔6〕。近年來，研究者不斷地深入研究DNA 甲基化及其在腫瘤發生發展中的作用機制。基因組通常含有兩類遺傳信息：由DNA序列提供的遺傳信息及提供了基因表達模式的表觀遺傳學信息。表觀遺傳信息主要的作用機制是DNA甲基化和(或)組蛋白乙酰化〔7〕。在表觀遺傳學中，研究最廣泛、最深入的領域就是DNA甲基化。在絕大多數的真核生物遺傳物質中，DNA甲基化過程被認為只會發生在胞嘧啶的第五位碳原子上，S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)為DNA甲基化過程提供甲基(-CH3)，經過DNA甲基轉移酶(DNMT)催化后，SAM的甲基被轉移到胞嘧啶的第五位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)〔8〕。有研究表明人類基因啟動子區約60%都含有CpG島，一旦CpG島發生甲基化，相應的染色體結構便會發生如高度螺旋、凝縮成團、失去轉錄活性等變化，使基因不能正常表達。DNA甲基化可使染色體結構修飾、基因組印跡、染色體失活等過程受到影響〔9〕。目前多種惡性腫瘤細胞對化療藥物的不敏感甚至產生耐藥的現象已經成為惡性腫瘤化療過程的一大障礙。化療藥物使惡性腫瘤細胞發生反應的過程離不開DNA修復基因的調節作用，若修復基因的基因啟動子區發生DNA甲基化，將會導致基因不能正常轉錄從而引起基因沉默最終使修復基因不能正常表達〔10〕。在惡性腫瘤組織細胞中，可通過調節與DNA修復過程相關基因的啟動子區的甲基化狀態，最終誘導腫瘤組織細胞獲得對化療藥物固有性耐藥的特性；且化療藥物本身就能刺激腫瘤細胞的藥敏基因，引起藥敏基因DNA甲基化狀態的變化，從而誘導惡性腫瘤細胞獲得性耐藥特性的產生。

研究者還發現DNA甲基化具有可逆性特征，存在耐藥性基因的甲基化狀態發生變化進而影響腫瘤細胞對化療藥物敏感性發生變化的可能〔11〕。如DNA修復相關基因O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)。MGMT是一種可逆轉由烷化劑引起的DNA損傷的DNA修復酶。故其在腫瘤細胞中表達升高可降低腫瘤細胞對烷化劑類化療藥物作用的敏感性，這是惡性腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性的分子基礎。在惡性腫瘤細胞和組織中，DNA甲基化轉移酶介導的MGMT啟動子區甲基化狀態改變是導致其活性降低的主要因素〔12〕。MGMT啟動子CpG島的甲基化使轉錄不能正常進行，進而影響該基因正常表達而發揮作用，最終導致基因沉默。研究者已在神經膠質瘤中對這種機制進行了大量研究〔13〕。MGMT基因啟動子的高甲基化狀態和惡性腫瘤組織細胞對烷化劑類藥物敏感性升高緊密相關，但MGMT甲基化水平與惡性腫瘤細胞對化療藥物敏感性之間并無明顯的相關性。冷曙光〔14〕對26株惡性黑色素瘤細胞系進行研究時發現，不同細胞系之間對替莫唑胺的敏感性并不相同，MGMT的活性和表達水平與惡性腫瘤細胞對替莫唑胺敏感性呈現出明顯的負相關關系；但對細胞系進行基因甲基化狀態的檢測結果顯示，在26株細胞系中，11株細胞系基因并沒有發生啟動子區甲基化，15株細胞系基因既有啟動子區甲基化又有未甲基化存在。提示MGMT基因啟動子區的甲基化水平與惡性腫瘤細胞對替莫唑胺敏感性并沒有顯著的相關性，表明在部分腫瘤細胞中，DNA甲基化改變并不是唯一能夠調節MGMT表達或活性的因素，也許存在其他影響因素，如單核苷酸多態性等可能也參與了MGMT的活性和表達，但具體機制仍需更深入研究與探討。

DAPK基因位于人類第9號常染色體q34.1上，其參與編碼翻譯的蛋白質是一種依賴于鈣離子/鈣調蛋白調節、相對分子質量為16×104的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它是一種參與細胞凋亡調節的正調控因子。在人體的正常組織中，DAPK基因可通過多條途徑參與細胞凋亡，研究證實，DAPK可通過依賴P19arf方式激活p53從而誘導細胞凋亡的發生；DAPK還可通過上調凋亡相關因子Bcl-2相關x蛋白(Bax)、p53上調凋亡調控因子(PUMA)、成人T淋巴細胞白血病PMA反應基因(Noxa)和凋亡酶激活因子(Apaf)-1等觸發線粒體凋亡途徑的發生。在缺乏p53的細胞中，DAPK也可觸發Ⅱ型自噬性細胞的死亡〔15〕。表明DAPK對啟動生命體細胞正常程序性死亡過程的發生起著重要作用。多項研究提示〔16〕，DAPK基因不正常表達主要因其基因上游啟動子區CpG島發生異常甲基化改變，抑制DAPK的基因轉錄為mRNA的過程，阻礙正常編碼死亡相關蛋白激酶，使死亡相關蛋白激酶的表達比正常水平降低，導致DAPK蛋白對細胞凋亡的調控失去控制，凋亡機制受到影響，引起細胞腫瘤化，DAPK對腫瘤的發生、發展及轉移有著重要聯系。華海蓉等〔17〕在對云錫礦工肺癌組織DAPK基因的蛋白表達及其甲基化異常現象研究時發現，礦工肺癌組織中缺少或缺乏DAPK基因的表達，表明DAPK基因異常甲基化改變可能參與了肺癌的發生發展。本研究表明，DAPK在肺癌患者中的痰液及血清中的表達均有所降低，其表達與腫瘤細胞的浸潤及淋巴結轉移有關。研究結果還表明，肺鱗癌患者痰液和血清中DAPK基因啟動子甲基化改變較良性肺部疾病患者升高，對初步區分腫良惡性有一定的意義。