NERP-1對大鼠下丘腦室旁核MNCs活動的影響機制

金鑫 張智哲 邱德來 李玉子 初春平

(延邊大學 1附屬醫院心內二療區，吉林 延吉 133000；2腦科學研究中心)

下丘腦室旁核(PVN) 是神經內分泌系統的重要整合中樞，主要由分泌加壓素(VP)和催產素(OT)的神經分泌大細胞(MNCs)、分泌促垂體激素和調控自主神經活動的神經分泌小細胞組成〔1～3〕,其中MNCs分泌的VP和OT不僅在維持水鹽平衡、血壓調節、分娩和泌乳等生理功能調節中起關鍵作用，而且與社會行為關系密切，在親善關系、社會認知、進攻行為、焦慮和應激反應中起重要作用〔4〕。

PVN MNCs從大腦廣泛的區域接收各種傳入信息，包括體液平衡和心血管狀態〔5〕，其中接收來至穹窿下器官(SFO)、自視前中央核(MNPO)、終板血管器(OVLT)、腦干核〔6〕和其他下丘腦內核〔7〕的傳入纖維，這些傳入纖維包含興奮性谷氨酸〔8〕和抑制性γ-氨基丁酸(GABA)能投射〔9〕，通過釋放谷氨酸或GABA對PVN MNCs的活動進行興奮和抑制調控，進而調節PVN MNCs的分泌活動〔8,9〕。

神經內分泌調節肽(NERP)-1是近年來在人甲狀腺髓樣癌TT細胞分離出的酰胺化肽，也是神經和內分泌系統所分泌的牛痘病毒生長因子(VGF)衍生物〔10～12〕。NERP-1在PVN中含量豐富，存在于NMCs的分泌顆粒中，與VP和OT共存〔13,14〕。NERP-1還存在于其他腦區，如視上核(SON)、弓狀核(ARC)、外側下丘腦(LH)、腹側結節-基底膜核、視交叉上核、大腦皮層、垂體、甲狀腺和胃腸道〔15～17〕。側腦室給予抗NERP-IgGS可抑制由水負荷引起的血漿VP減少， 表明NERP可能是一種有效的內源性VP釋放抑制因子，提示NERP-1在神經內分泌系統中發揮重要的調節作用。在下丘腦PVN中的NERP-1與VP與OT共存，提示NERP-1可能影響PVN MNCs活動與突觸傳遞，參與調節MNCs的分泌功能。側腦室或下丘腦外側區注射NERP-2能增加大鼠攝食、耗氧量和運動活動，提示NERP-2影響中樞神經系統活動，調節能量代謝〔18,19〕。此外，Toshinai等〔20〕研究發現，NERP-1可抑制PVN MNCs的興奮性，導致MNCs超極化，放電頻率降低，但NERP-1抑制PVN MNCs興奮性的突觸機制尚不清楚。本文旨在探討NERP-1對大鼠PVN神經分泌大細胞活動影響的突觸機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 由延邊大學實驗動物管理中心獲得，與母鼠共同飼養出生2～3周齡的雄性Wistar系大鼠。實驗全部按照美國國立衛生研究院的動物保護條例進行，并由延邊大學動物保護委員會監督。

1.2實驗儀器 Multiclamp 20OB膜片鉗放大器(Molecular Devices，USA)，Nikon LV-TV膜片鉗專用顯微鏡(Nikon，Japan)，Clampex 10.4記錄和分析軟件(Molecular Devices，USA)，Digital1550AD/A數模轉換器(Molecular Devices，USA)，Picospritzer1 壓力注射系統(Parker Hannifin Co.Pine Brook,NJ)，MP-285微操縱器(Sutter Instrument,Novato,USA)，Gilson Minipulse 3蠕動泵(Villiers,Le BelFrance)，萊卡1200S全自動振動切片機(Leica，Germany)PB-10拉制儀(Narishige，Japan)，電子天平(Sartorius，Germany)，精密臺式PH測定儀(Thermo，USA)，Westor 5520露點滲壓儀(Westor，USA)，MASTER8刺激器(A.MP.L.)。

1.3實驗藥品 (1)KCl、NaHCO3、NERP-1、Picrotoxin，tetrodotoxin (TTX)，D-Glucose，KT5720，PKI，NaH2PO4·2H2O，Na2HPO3·12H2O等試劑訂購于Sigma公司。(2)人工腦脊液(ACSF)：10 mmol/L D-glucose，125 mmol/L NaCl，3 mmol/L KCl，25 mmol/L NaHCO3，1 mmol/L MgSO4，1 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L CaCl2。(3)電極內液：1 mmol/L EGTA，5 mmol/L KCl，120 mmol/L potassium gluconate，4 mmol/L NaCl，8 mmol/L biocytin，10 mmol/L HEPES，3.5 mmol/L MgCl2，4 mmol/L Na2ATP，0.2 mmol/L Na2GTP(pH：7.3 )。(4)生物素染色試劑：磷酸鹽緩沖液，40% H2O2，ABC試劑盒，Triton100。

1.4下丘腦急性腦片制備 選取本校實驗動物管理中心提供的與母鼠共同飼養的Wistar雄性大鼠(出生后2～3 w)，使用異氟烷吸入麻醉，待動物深度麻醉后迅速斷頭、取出腦組織。隨后將取出的腦組織置于充有混合95% O2和5%CO2氣體的冰冷ACSF中。ACSF含有的成分包括：NaCl(118 mmol/L),NaHCO3(25 mmol/L),D-Glucose(10 mmol/L),KCl(3 mmol/L),CaCl2(2 mmol/L)，MgCl 2.6H2O(1 mmol/L),NaH2PO4·2H2O(1 mmol/L)。滲透壓為295～300 mOsM，pH值為7.25～7.35。應用振動切片機制備厚度為250 μm，含有PVN的下丘腦切片。在室溫(24～25℃)條件下，將切片置于持續充有混合氣體(95% O2和5% CO2)的ACSF中孵育1 h以上。

1.5全細胞膜片鉗記錄 使用微電極拉制儀(PB-10，Narishige，Japan)將細小玻璃管(外徑:1.5 mm，Narishige，Japan)拉制成刺激電極和記錄電極。在記錄電極內注入10 μl電極內液，其組分包括：120 mmol/L Potassium Gluconate,8 mmol/L biocytin,5 mmol/L KCl,4 mmol/L Na2ATP，1 mmol/L EGTA,4 mmol/L NaCl，10 mmol/L HEPES,0.2 mmol/L Na2GTP,3.5 mmol/L MgCl2，pH值為7.3。記錄電極的阻抗為3～7 MΩ。在電流鉗下，觀察神經元的自發性放電活動，研究灌流NERP-1對PVN MNCs區域神經元的自發性放電頻率、靜息膜電位和細胞膜特性的影響。在電壓鉗下，觀察自發性的微小興奮性突觸后電流(mEPSCs)，觀察NERP-1對MNCs mEPSC的影響。只有完整記錄并基線相對穩定的電生理數據才能用于最后的數據處理和統計學分析，數據儲存在實驗室的電腦和移動硬盤上。NERP-1、電壓依存性鈉離子通道阻斷劑河豚毒素(TTX)、非選擇性谷氨酸受體阻斷劑犬尿喹啉酸(KYC)、GABAA受體阻斷劑Picrotoxin通過蠕動泵給藥。

1.6生物素染色 膜片鉗電極內液中含有8%的生物素，電生理實驗記錄所用的腦切片用4%多聚甲醛進行固定24 h以上后，進行免疫組織化學染色(ABC Elitekit)、封片、顯微照相，在顯微鏡下觀察記錄細胞的位置、形態學特點及軸突和樹突的分布與投射情況。

1.7統計學分析 神經元的自發性放電頻率的分析使用Clampfit10.4軟件，mEPSCs的分析采用MiniAnalysis (6.0)軟件。數據的統計學分析采用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1PVN MNCs的電生理一般特征 在電流鉗記錄模式下，共有63個所記錄細胞符合MNCs電生理特性，被認定為PVN MNCs，這些神經元對注入電流表現出明顯的外向整流特征，見圖1。在電生理實驗記錄結束后進行固定、染色，在顯微鏡下觀察到胞體、軸突和樹突符合MNCs特征，將其確定為MNCs。

圖1 MNCs的電生理特性

2.2NERP-1對PVN MNCs自發性放電活動的影響 在電流鉗記錄模式下(I=0 pA)，灌流100 nmol/L NERP-1，持續2 min，PVN MNCs的自發性放電活動頻率顯著降低，NERP-1的抑制作用大概在給藥5 min后達到峰值，用ACSF沖洗后逐漸恢復至用藥前的自發性動作電位的放電水平(圖2A、B)。100 nmol/L的NERP-1可以導致MNCs的放電頻率降低至(34.5±4.14)%，膜電位從(-50.0±1.1)mV超極化到(-53.1±1.4)mV，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2C。

2.3離子型谷氨酸受體阻斷劑對NERP-1導致PVN MNCs自發性放電頻率降低的影響 在電流鉗下，給予KYC可導致PVN MNCs放電頻率明顯降低(P<0.05)，并完全阻斷NERP-1對MNCs的抑制作用。在KYC存在下，給予NERP-1沒有對神經元的自發性活動產生顯著影響，與單獨給予KYC相比沒有顯著差異(P>0.05)。見圖3。

2.4GABAA受體阻斷劑對NERP-1導致PVN MNCs自發性放電頻率降低的影響 阻斷GABAA受體后，PVN MNCs的自發性放電頻率顯著增加(P<0.05)，但沒有阻斷NERP-1對PVN MNCs的自發性放電的影響，見圖4。

2.5NERP-1對PVN MNCs興奮性谷氨酸能突觸傳遞的影響 在電壓依存性鈉離子通道阻斷劑(TTX，0.5 μmol/L)存在條件下，給予100 nmol/L NERP-1后可以明顯降低MNCS 的mEPSCs頻率，導致mEPSCs間隔顯著增大，EPSCs概率-頻率曲線右移(圖5A,B);但mEPSCs的振幅較給藥前后沒有顯著變化，概率-振幅曲線變化不明顯(圖5A、C)。NERP-1可導致MNCs mEPSCs頻率減少到給藥前的〔(63.4±3.6)%〕，與給藥前〔(100.0±4.7 )%〕相比有顯著差異(P<0.01)，但NERP-1對mEPSCs的振幅沒有顯著影響，振幅為給藥前的〔(97.7±1.2)%,P<0.05〕。

(A)在電流鉗記錄模式下，PVN MNCs自發性放電頻率的變化。(B)NERP-1誘導PVN MNCs放電頻率變化的時程。(C)ACSF、NERP-1、洗出時PVN MNCs的膜電位的比較圖2 NERP-1對 PVN MNCs的自發性放電活動的影響

圖3 離子型谷氨酸受體拮抗劑對NERP-1誘導的PVN MNCs放電頻率降低的影響

圖4 GABAA受體阻斷劑對NERP-1導致PVN MNCs自發性放電頻率降低的影響

(A)電壓鉗記錄模式下，在ACSF、NERP-1和洗出條件下記錄PVN MNCs mEPSCs。(B)ACSF、NERP-1和洗出中PVN MNCs的累積概率-頻率曲線。(C)ACSF、NERP-1和洗出中PVN MNCs的累積概率-振幅曲線圖5 在TTX存在條件下，NERP-1對MNCs mEPSC的影響

3 討 論

NERP-1在PVN中含量豐富，與VP和OT共存，在調節水鹽代謝和VP釋放方面起至關重要的作用。本實驗應用全細胞膜片鉗記錄和神經藥理學手段研究了NERP-1對PVN NMCs影響的突觸機制，發現給予NERP-1可導致PVN MNCs放電頻率顯著降低并伴隨明顯的膜電位超極化，NERP-1導致的MNCs的放電頻率降低可以被非選擇性離子型谷氨酸受體拮抗劑KYC，但對GABAA受體阻斷劑不敏感，此外，NERP-1顯著降低MNCs的mEPSCs發生頻率，但對其振幅沒有顯著影響。本研究結果表明NERP-1 通過突觸前途徑下調興奮性谷氨酸能傳入纖維終端的遞質釋放，降低下丘腦PVN神經分泌大細胞的興奮性，提示NERP-1通過間接方式抑制PVN MNCs的活動與分泌。

下丘腦PVN主要由分泌VP和OT的神經分泌大細胞、分泌促垂體激素和調控自主神經活動的神經分泌小細胞組成，是神經內分泌系統的重要整合中樞〔1～3〕。PVN MNCs主要包括VP和OT神經元，分泌VP、OT等多種激素和生物活性物質，調節和維持機體的許多重要生理功能。VP和OT主要參與維持水鹽平衡、血壓調節、分娩和泌乳等機體功能調節，且在親善關系、社會認知、進攻行為、焦慮和應激反應中都起重要作用〔4〕。而NERP-1在PVN MNCs的分泌顆粒中與VP和OT共同存在，而這些MNCs的軸突終止于垂體后葉，垂體后葉中的NERP-1、VP和OT亦可分泌到全身循環中，調節水鹽代謝，參與血壓調節及分娩和泌乳等機體功能，參與親善關系、社會認知、進攻行為、焦慮和應激反應〔13,14〕。

NERP是一種參與體液內穩態的新型生物活性肽，以自分泌、旁分泌或內分泌方式調節其他神經肽的作用和分泌。NERP-1在神經內分泌調節、水鹽代謝、攝食、能量代謝及中樞神經系統退行性疾病的發生、發展中起不可忽視的作用。側腦室注射高滲鹽水或血管緊張素Ⅱ可提高大鼠血漿VP水平，而這種作用可以被側腦室注射NERP-1抑制。此外，側腦室注射NERP-1 IgG抗體可以逆轉急性水負荷引起的血漿VP抑制，提示NERP是調節VP分泌的內源性肽。大鼠下丘腦切片實驗表明，NERP-1可逆地抑制了VP分泌和血管緊張素Ⅱ誘導的VP分泌，但NERP-1-Gly和NERP-2-Gly不能抑制VP的分泌。分泌VP的MNCs將軸突投射到垂體后葉并進入到全身的循環系統中。NERPs 還可以抑制大鼠垂體后葉的VP分泌，因此，NERPs 可能是VP分泌的內源性抑制因子〔21,22〕。

已有研究發現NERP-1可通過抑制谷氨酸能神經元向PVN神經分泌大細胞的釋放從而抑制MNCs的興奮性，但其突觸機制尚不明確〔20〕。本研究是在前期研究的基礎上，進一步觀察了NERP-1對PVN MNCs突觸傳遞的影響。研究結果與前期報道〔20〕相一致，發現NERP-1可引起PVN MNCs抑制，出現放電頻率降低。應用了離子型谷氨酸受體阻斷劑KYC，結果提示局部蠕動灌流NERP-1顯著降低PVN MNCs的放電頻率是通過抑制興奮性谷氨酸能突觸傳入來實現的。給予了GABAA受體阻斷劑Picrotoxin，結果提示NERP-1 引起PVN MNCs放電頻率的降低是通過抑制興奮性谷氨酸能突觸傳入而并非通過增強GABA能突觸傳入來實現的。在電壓依存性鈉離子通道阻斷劑TTX的存在下，NERP-1可以明顯降低敏感神經元mEPSCs的頻率，但對mEPSCs振幅較沒有顯著影響，提示NERP-1可通過降低突觸前神經元末梢的興奮性谷氨酸能突觸傳遞的這一可能性，從而抑制對部分PVN MNCs的興奮性。

綜上，NERP-1可顯著抑制PVN MNCs的放電頻率并伴隨明顯的膜電位超極化，NERP-1導致放電頻率降低可以被非選擇性離子型谷氨酸受體拮抗劑阻斷，但對GABAA受體阻斷劑不敏感，NERP-1 通過突觸前途徑抑制興奮性谷氨酸能傳入纖維終端的遞質釋放，降低下丘腦PVN NMCs的興奮性，提示NERP-1間接抑制PVN MNCs的活動與分泌。