ApoE基因缺陷與SD大鼠急性腦缺血模型穩(wěn)定性比較

王雄 鄔玉芹 陳紅 張武 何占平 陳澤谷 夏鷹 余丹 陳晶

(海口市人民醫(yī)院暨中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院，海南 海口 570208)

隨著分子生物學(xué)發(fā)展，利用基因缺陷動(dòng)物建立相關(guān)模型已成為科研工作的重要方向〔1〕。本研究結(jié)合國(guó)內(nèi)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立缺血性腦卒中模型的經(jīng)驗(yàn)〔2～4〕，利用改良線栓法建立載脂蛋白(Apo)E基因缺陷大鼠和野生型大鼠局灶性缺血模型，依據(jù)建模成功率、神經(jīng)功能評(píng)分、磁共振成像(MRI)影像學(xué)表現(xiàn)對(duì)模型的成功率和穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在探討建立穩(wěn)定的腦卒中動(dòng)物模型，更好地為缺血性腦卒中機(jī)制研究和治療效果的評(píng)價(jià)提供切實(shí)可行的基礎(chǔ)和前提。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用雄性ApoE(-/-)基因剔除大鼠100只，SPF級(jí)雄性SD大鼠100只，年齡約6周齡且體重為0.18～0.22 kg，本實(shí)驗(yàn)中使用的大鼠購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心，動(dòng)物均可自由攝食標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來(lái)水，置于12/12 h光/暗周期環(huán)境下24℃安靜溫控動(dòng)物房籠中(每籠5只大鼠)飼養(yǎng)，相對(duì)濕度45%左右，通風(fēng)良好，每籠3～5只飼養(yǎng)，依據(jù)大鼠品系分為兩組。

1.2動(dòng)物模型制備 局灶性腦缺血再灌注模型制作參照文獻(xiàn)等〔5〕方法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型,根據(jù)文獻(xiàn)等〔6,7〕的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，本研究評(píng)分采用雙盲法，由未參與實(shí)驗(yàn)分組者完成，防止選擇偏倚影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)選擇2～3分模型作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物模型均在術(shù)后3 d和7 d再次進(jìn)行評(píng)分，評(píng)價(jià)神經(jīng)功能狀態(tài)。腦梗死灶范圍測(cè)量采用雙盲法用圖像處理軟件(Image-Pro Plus6.0)測(cè)量和計(jì)算梗死腦組織的體積百分比，MRI數(shù)據(jù)采集使用美國(guó)GE公司signa HDX 3.0 T MR機(jī)掃描,上海辰光醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的專用相控陣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物線圈(大鼠，5 cm孔徑)對(duì)大鼠行顱腦MRI掃描。將兩組缺血性腦卒中動(dòng)物模型均在缺血24 h、3 d和7 d時(shí)行MRI掃描，均行MRI-DWI、T2WI、PWI掃描，動(dòng)態(tài)觀察不同MR掃描序列不同掃描時(shí)間的影像表現(xiàn)情況。

1.3缺血性腦卒中動(dòng)物模型成功的神經(jīng)病學(xué)標(biāo)志 手術(shù)側(cè)表現(xiàn)出Honer征，出現(xiàn)強(qiáng)迫體態(tài)和對(duì)側(cè)前肢偏癱，爬行時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈、追尾現(xiàn)象等〔8〕。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同類別大鼠缺血性腦卒中動(dòng)物模型行為學(xué)評(píng)分 ApoE基因缺陷組75只成功大鼠模型，缺血再灌注后3 d NSS評(píng)分顯著高于7 d(P<0.001)；缺血再灌注后3 d及7 d BWT評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.393)。SD組73只成功大鼠模型，缺血再灌注后3 d、7 d NSS、BWT評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；見表1。

表1 兩組NSS、BWT評(píng)分比較分)

2.2MRI 在MR-DWI及T2WI圖像上均能看到缺血側(cè)與對(duì)側(cè)(非缺血側(cè))影像存在明顯差異，但缺血區(qū)域均表現(xiàn)為明顯的高信號(hào)，兩組DWI序列顯示缺血灶邊界較T2WI更加清晰；ApoE基因缺陷組與SD組1、3、7 d腦缺血容積百分比分別為16.5%、18.5%、10.5%和9.0%、11.0%、5.5%，相同時(shí)點(diǎn)兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；兩組缺血?jiǎng)游锬Ｐ头秶入S時(shí)間推移呈擴(kuò)大趨勢(shì)，然后缺血范圍呈現(xiàn)不斷縮小趨勢(shì)；各時(shí)間點(diǎn)SD組缺血范圍均較ApoE組大且明顯，由缺血24 h到7 d內(nèi)缺血灶變化范圍ApoE組更為明顯。兩種模型制作成功后MRI掃描清晰顯示大鼠腦組織缺血及水腫情況，T2WI和DWI均呈顯著高信號(hào)，于缺血手術(shù)后1 w水腫達(dá)高峰期，ApoE基因缺陷組與SD組1、3、7 d兩側(cè)大腦半球不對(duì)稱百分比分別為-4.5%、7.0%、6.5%和-5.0%、10.0%、-4.5%，相同時(shí)點(diǎn)兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩側(cè)大腦半球比值方向發(fā)生明顯變化。隨時(shí)間推移，水腫程度呈不同程度緩解，T2WI信號(hào)逐漸減低，以缺血灶周邊明顯，梗死中心區(qū)腦組織逐漸液化；彌散系數(shù)b=1 000時(shí)的DWI圖高信號(hào)為新鮮梗死區(qū)，缺血再灌注3 d內(nèi)信號(hào)及缺血容積均呈上升趨勢(shì)，提示水腫逐漸加重，7 d后信號(hào)逐漸降低，提示水腫有所減輕。見圖1及圖2。

圖1 兩組腦卒中動(dòng)物模型不同MRI掃描序列影像隨掃描時(shí)間的變化

圖2 兩組不同時(shí)點(diǎn)MRI-DWI

3 討 論

本研究結(jié)合國(guó)內(nèi)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，ApoE基因缺陷大鼠與SD大鼠兩組模型3 d內(nèi)成功率高分別為76%和77%。成模過(guò)程中大鼠死亡的原因多為蛛網(wǎng)膜下腔出血、麻醉過(guò)度、由于對(duì)氣道或迷走神經(jīng)刺激過(guò)多過(guò)重致氣道分泌物多從而呼吸困難和窒息死亡、梗死面積過(guò)大〔9〕；神經(jīng)功能缺損評(píng)分過(guò)低的大鼠可見腦部無(wú)梗死，可能為大腦中動(dòng)脈閉塞不完全，早期出現(xiàn)不慎再灌注或梗塞范圍很小，多為大腦中動(dòng)脈更小的分支供血區(qū)〔10〕。

通過(guò)Zea-Longa評(píng)分對(duì)ApoE基因缺陷與SD組MCAO模型的行為時(shí)間穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，術(shù)后ApoE基因缺陷大鼠模型NSS評(píng)分7 d比3 d有所降低，考慮與梗死后水腫逐漸改善致功能缺損有一定程度恢復(fù)有關(guān)，但橫木行走試驗(yàn)改善不明顯，難度大的測(cè)試可以使恢復(fù)程度更難辨別；SD組NSS及WBT評(píng)分3 d與7 d差異明顯，神經(jīng)功能評(píng)分從行為學(xué)角度說(shuō)明SD大鼠模型的行為穩(wěn)定性較ApoE轉(zhuǎn)基因大鼠MCAO模型的穩(wěn)定性差。MRI-DWI的物質(zhì)基礎(chǔ)是組織中水分子無(wú)規(guī)則的熱運(yùn)動(dòng)，也是目前測(cè)量活體水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)成像的唯一方法。對(duì)兩種腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ途蠱RI-DWI掃描，對(duì)比SD和ApoE(-/-)DWI影像發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間推移SD組栓塞側(cè)腦組織高信號(hào)范圍變化較ApoE(-/-)大而明顯，特別是MRI灌注融合圖像能夠清晰顯示兩種模型的缺血核心和缺血半暗帶范圍差異。不少學(xué)者認(rèn)為缺血半暗帶恢復(fù)血供后可恢復(fù)正常功能，不少學(xué)者認(rèn)為缺血半暗帶的存在對(duì)于缺血再灌注和臨床溶栓時(shí)間窗的把握有重要意義〔5，11〕。MRI從形態(tài)影像學(xué)角度證實(shí)了SD大鼠模型形態(tài)影像的穩(wěn)定性較Apo-E轉(zhuǎn)基因大鼠模型穩(wěn)定性差。本研究結(jié)果顯示，ApoE基因缺陷大鼠模型的時(shí)間穩(wěn)定性明顯優(yōu)于SD大鼠模型。

綜上，可用ApoE基因缺陷大鼠制備穩(wěn)定、可重復(fù)性強(qiáng)、操作相對(duì)簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小、成功率高的大鼠模型，為進(jìn)一步研究缺血性腦卒中的病因病機(jī)及治療方法提供良好的技術(shù)支持。ApoE基因缺陷大鼠制備缺血性腦卒中動(dòng)物模型，與人群常見缺血性卒中發(fā)病過(guò)程類似，且穩(wěn)定性較好，能夠很好地模擬人缺血性腦卒中發(fā)病的病理生理機(jī)制，在腦卒中機(jī)制和臨床研究中有廣闊的應(yīng)用前景。