下調miR-372靶向調控BTG1表達對膠質瘤細胞分泌免疫抑制因子的影響

蘇保壽 薛治乾 余鵬飛 吳益敏 喻聞慶

(儋州市人民醫院 1神經外科，海南 儋州 571799；2病理科)

膠質瘤是常見的中樞神經系統腫瘤，具有預后差、易復發等特點〔1〕。研究表明，免疫逃逸是腫瘤惡性進展的重要原因，腫瘤細胞分泌合成的免疫抑制因子如轉化生長因子(TGF)-β1、血管內皮生長因子(VEGF)、白細胞介素(IL)-8是誘導腫瘤細胞免疫逃逸的基礎〔2〕。miRNA具有功能多樣的特點，分別在不同的組織及生理進程中發揮作用，與多種細胞的生長、運動、能量代謝等有關〔3〕。研究顯示，miRNA與腫瘤的發生密切相關，其不僅參與腫瘤細胞的惡性表型的轉變過程，還與腫瘤的免疫逃逸有關，研究miRNA在腫瘤中的作用對于腫瘤的治療和闡明腫瘤分子發生機制具有重要意義〔4〕。miR-372參與腫瘤進程，在肺鱗癌、肝癌中的研究報道顯示，miR-372作為一種腫瘤促進因子誘導癌細胞增殖，而在卵巢癌中發現miR-372作為一種抑癌基因發揮抗腫瘤作用〔5～7〕。在膠質瘤中的研究表明，miR-372表達上調與膠質瘤患者預后不良有關，并且下調miR-372可以抑制膠質瘤細胞侵襲和遷移，誘導膠質瘤細胞凋亡，miR-372在膠質瘤進展中發揮類似癌基因的作用〔8,9〕。目前對于miR-372在膠質瘤細胞分泌免疫抑制因子中的作用還不明確。本實驗探討下調miR-372對膠質瘤細胞U251分泌免疫抑制因子TGF-β1、VEGF、IL-8的影響和靶向調控機制，為研究miR-372在腫瘤免疫逃逸中的作用提供參考，為靶向基因治療膠質瘤提供依據。

1 材料與方法

1.1材料 膠質瘤細胞U87、U251、SHG-44和正常星形膠質細胞NHA購自美國ATCC；IL-8含量檢測試劑盒購自上海康朗生物科技有限公司；siRNA對照(control)、B細胞易位基因(BTG)1 siRNA由廣州易錦生物技術有限公司構建；VEGF含量檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen；抑制劑(inhibitor)control、miR-372 inhibitor、模擬物(mimics)control、miR-372 mimics由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；TGF-β1含量檢測試劑盒購自上海紀寧實業有限公司；BTG1抗體購自美國Proteintech；野生型(WT)和突變型(MUT)熒光素酶報告載體由湖南豐暉生物科技有限公司構建。

1.2miR-372在膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞中表達差異檢測 收集膠質瘤細胞U87、U251、SHG-44和正常星形膠質細胞NHA，用Realtime PCR方法測定miR-372水平。以Trizol試劑提取細胞中的總RNA，按照如下體系合成cDNA，包括：1 μl的RNA、8 μl的RNase-free Water、2 μl的5×PrimersScript RT Master Mix，cDNA合成條件為：37℃孵育15 min，85℃孵育5 s；按照如下體系進行Realtime PCR，包括：5 μl的2×SYBR緩沖液、上下游引物各0.5 μl、1 μl的cDNA，添加雙氧水(ddH2O)至25 μl。反應程序為：94℃孵育4 min；94℃孵育30 s；60℃孵育15 s；72℃孵育30 s，一共30個循環。內參U6引物：正義鏈-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT；反義鏈-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT；miR-372引物：正義鏈-CAACAGAAGGCTCGAGCAACCTGCGGAGAAGATAC；反義鏈-TTCTGATCAGGATCCCATTACAGCCAGACGCTGTAAG。用2-△△Ct法分析miR-372水平。

1.3細胞轉染和下調效果檢測 膠質瘤細胞U251分成Control組、Anti-NC組、Anti-miR-372組，Anti-NC組、Anti-miR-372組分別為使用Lipofectami-ne2000轉染inhibitor control、miR-372 inhibitor的細胞，Control組為沒有轉染的細胞。細胞轉染步驟完全按照Lipofectamine2000轉染試劑說明書進行。細胞轉染后48 h，收集細胞，按照1.2中Realtime PCR方法測定下調效果。

1.4下調miR-372對膠質瘤細胞分泌TGF-β1、VEGF、IL-8的影響檢測 使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測TGF-β1、VEGF、IL-8水平。收集培養48 h以后的Control、Anti-NC、Anti-miR-372組細胞培養液上清，分別使用TGF-β1、VEGF、IL-8含量測定試劑盒檢測上清中TGF-β1、VEGF、IL-8水平，步驟完全按照試劑盒操作說明進行。

1.5miR-372靶基因預測和鑒定 生物信息學軟件targetscan預測miR-372的靶基因，結果發現BTG1的3'UTR端與miR-372有互補結合位點，使用熒光素酶報告系統鑒定靶向關系。將WT和MUT熒光素酶報告載體分別同mimics control、miR-372 mimics共轉染到膠質瘤細胞U251中，培養48 h以后，用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。WT熒光素酶報告載體含有BTG1的3′UTR端結合位點，MUT熒光素酶報告載體含有突變以后的BTG1的3′UTR端結合位點。

1.6下調miR-372對膠質瘤細胞中BTG1蛋白表達影響檢測 收集培養48 h以后的Control、Anti-NC、Anti-miR-372組細胞，分別添加0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，然后在每個孔中添加200 μl的裂解溶液，用細胞刮刀收集裂解液，放在冰上裂解30 min。收集上清(蛋白上清)，添加到上樣緩沖液中混合，100℃煮沸5 min。上樣(每孔上樣30 μg)，在上層膠中使用90 V電泳，在下層膠中使用120 V電泳。以300 mA電流轉膜1 h。將硝酸纖維素(NC)膜放在封閉液中孵育1.5 h。把NC膜放在一抗反應液中，在4℃過夜。NC膜放在HRP標記的二抗稀釋液中，置于室溫中孵育1 h。電化學發光(ECL)顯色。用Image J分析條帶的灰度值，GAPDH作為內參，分析BTG1蛋白水平。BTG1一抗稀釋倍數為1∶1 000，二抗稀釋倍數為1∶2 000，抗體均用封閉液稀釋，封閉液為5%牛血清白蛋白的TBST。

1.7BTG1 siRNA對下調miR-372影響膠質瘤細胞分泌TGF-β1、VEGF、IL-8的作用檢測 膠質瘤細胞中BTG1分別共轉染miR-372 inhibitor、siRNA control和miR-372 inhibitor、BTG1 siRNA，記為Anti-miR-372+si-NC組、Anti-miR-372+si-BTG1組，細胞培養48 h以后，收集細胞和培養液上清，ELISA方法測定培養液上清中TGF-β1、VEGF、IL-8水平，Western印跡檢測細胞中BTG1蛋白表達，步驟同上。

1.8統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1miR-372在膠質瘤細胞中表達上調 膠質瘤細胞U87(1.85±0.12)、U251(2.36±0.27)、SHG-44(1.64±0.15)中miR-372表達水平高于正常星形膠質細胞NHA(1.00±0.09)，膠質瘤細胞U87、SHG-44中miR-372表達水平顯著低于膠質瘤細胞U251。miR-372在膠質瘤細胞中表達上調。選用膠質瘤細胞U251做后續實驗。

2.2miR-372 inhibitor下調膠質瘤細胞U251中miR-372表達水平 在膠質瘤細胞U251中轉染miR-372 inhibitor，細胞中的miR-372表達水平顯著下降，見表1。

2.3下調miR-372提高膠質瘤細胞U251中BTG1蛋白表達 在膠質瘤細胞U251中轉染miR-372 inhibitor，細胞中BTG1蛋白水平顯著升高，見表1和圖1。

表1 miR-372 inhibitor轉染后膠質瘤細胞U251中miR-372及BTG1蛋白水平比較

圖1 Western印跡檢測miR-372 inhibitor轉染后膠質瘤細胞U251中的BTG1蛋白表達

2.4下調miR-372抑制膠質瘤細胞分泌TGF-β1、VEGF、IL-8 在膠質瘤細胞U251中轉染miR-372 inhibitor，細胞培養液上清中TGF-β1、VEGF、IL-8水平顯著下降，見表2。

表2 miR-372 inhibitor轉染后膠質瘤細胞U251培養液上清中TGF-β1、VEGF、IL-8水平

2.5miR-372靶向調控BTG1蛋白表達 生物學信息學軟件發現miR-372與BTG1的3′UTR端結合位點，通過熒光素酶報告系統鑒定發現BTG1受到miR-372的靶向調控作用，見圖2和表3。

圖2 miR-372與BTG1的3′UTR端結合位點

表3 熒光素酶活性

2.6BTG1 siRNA逆轉下調BTG1抑制膠質瘤細胞U251分泌TGF-β1、VEGF、IL-8 與共轉染miR-372 inhibitor和siRNA control的細胞比較，共轉染miR-372 inhibitor和BTG1 siRNA后的膠質瘤細胞U251培養液上清中TGF-β1、VEGF、IL-8水平顯著升高，細胞中BTG1蛋白表達水平顯著下降，見圖3和表4。

1～2：Anti-miR-372+si-NC組、Anti-miR-372+si-BTG1組圖3 Western印跡檢測miR-372 inhibitor和BTG1 siRNA共轉染后膠質瘤細胞U251中BTG1蛋白水平

表4 miR-372 inhibitor和BTG1 siRNA共轉染后膠質瘤細胞U251中BTG1蛋白水平和分泌TGF-β1、VEGF、IL-8水平

3 討 論

miRNA是近些年來發現的單鏈RNA，目前已經發現有超過1 000多種miRNA，miRNA可以通過特異性的識別靶標進而調控靶mRNA的表達〔10〕。研究表明，miRNA與腫瘤的進展有關，在腫瘤發生中發揮類似癌基因或者是抑癌基因的作用，miRNA參與腫瘤細胞惡性生物學行為及腫瘤免疫逃逸過程〔11，12〕。miR-372是目前發現的與腫瘤進展關系十分密切的調節因子，其參與腫瘤細胞惡性增殖、轉移等過程，并且在不同的腫瘤中的作用不同〔13〕。在白血病、肺癌、肝癌等腫瘤患者中發現miR-372表達上調，miR-372具有促進腫瘤細胞惡性進展作用，下調miR-372表達抑制腫瘤轉移和生長〔5，6,14〕。在卵巢癌中的研究表明，miR-372可以下調卵巢癌細胞的轉移和上皮間充質轉化(EMT)能力，miR-372在卵巢癌中扮演抑癌基因的作用〔7〕。研究顯示，miR-372在膠質瘤組織中高表達，其可以促進膠質瘤細胞的惡性生長和轉移，miR-372表達上調與膠質瘤患者預后差有關〔8，9〕。本實驗顯示，miR-372在膠質瘤細胞中的表達水平明顯升高，這與之前的研究結果相符合，均提示miR-372在膠質瘤中高表達，miR-372在膠質瘤中發揮類似癌基因的作用。

腫瘤免疫逃逸是近些年來研究的熱點，腫瘤細胞能夠合成并分泌多種細胞因子促進腫瘤進展和轉移〔15〕。TGF-β1、VEGF、IL-8是腫瘤發生過程中的促進因子，能夠誘導腫瘤免疫逃逸發生，其在腫瘤組織中表達水平異常升高〔16，17〕。本研究顯示，下調miR-372后的膠質瘤細胞分泌的TGF-β1、VEGF、IL-8減少，提示下調miR-372可以抑制膠質瘤細胞分泌免疫抑制因子，miR-372可能通過參與腫瘤免疫逃逸過程介導腫瘤進展。

miRNA是一種新型的基因調節劑，其可以調控mRNA的表達發揮生物學作用〔18〕。miRNA通過影響不同的靶mRNA的翻譯而調控機體發育，并且同一個miRNA可以通過影響不同的靶基因表達而發揮不同的生物學作用〔19，20〕。本實驗顯示，miR-372靶向調控膠質瘤細胞中BTG1表達，BTG1可能是miR-372影響膠質瘤進展的機制之一。BTG1屬于BTG/Tob家族成員之一，其是在研究B型淋巴細胞白血病中發現的，BTG1具有抗細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用，與很多腫瘤如肝癌、胃癌、胰腺癌等的發生及發展密切相關，BTG1在腫瘤進展中發揮類似抑癌基因的作用〔21～23〕。在膠質瘤中研究顯示，BTG1可以作為一種抑癌基因成為膠質瘤治療的靶點〔24〕。本實驗結果表明，下調BTG1可以抑制下調miR-372對膠質瘤細胞分泌TGF-β1、VEGF、IL-8的抑制作用，提示下調miR-372通過靶向調控BTG1表達參與膠質瘤細胞分泌免疫抑制因子過程。

綜上，miR-372在膠質瘤免疫逃逸中可能發揮促進作用，下調miR-372抑制膠質瘤細胞分泌免疫抑制因子，其作用機制與靶向調控BTG1的表達有關。在以后研究中會繼續探討miR-372在腫瘤中的調控網絡和機制。