基于miR-34a/SIRT1通路研究電針刺激對腦卒中大鼠神經功能恢復的促進作用

高國強 馮亞男 崔華峰

(1濟寧醫學院附屬滕州市中心人民醫院，山東 滕州 277599；2滕州市中醫醫院；3山東中醫藥大學附屬醫院針灸科)

腦卒中是臨床中常見的腦血管疾病，致殘率與致死率高，對神經功能造成傷害，影響患者日后正常生活，有效促進腦梗死患者神經功能恢復是目前臨床亟待解決的問題〔1,2〕。電針刺激是指在刺入人體穴位的毫針上，用電針機通以微量低頻脈沖電流的一種治療方法。研究顯示電針刺激對神經功能的恢復有幫助〔3〕，但其機制尚未完全清楚。SIRT1是最早在酵母中發現的一種可調控壽命基因，研究顯示其在神經保護中發揮重要作用〔4〕。研究發現在動物體內，miR-34a分子主要表達于腦組織，可調控SIRT1參與一系列生理病理活動〔5〕。因此本研究構建大鼠大腦動脈閉塞模型，并基于miR-34a/SIRT1通路探討電針刺激對大鼠神經功能恢復的作用并探討可能機制。

1 材料與方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠50只，體重180～200 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，專用標準顆粒飼料、水喂養，實驗動物使用許可證號：SYXK(湘)2014-0012，實驗動物生產許可證號：SCXK(湘)2014-0002。大鼠均于室內通風柜中飼養，手術前1 d晚上禁食。環球牌針灸針(直徑0.25 mm，長度30 mm)購自豪嘉醫療器械專營店，華佗牌SDZ-Ⅱ型針灸治療儀購自重慶美樂醫療器械有限公司。Trizol試劑盒(12183555)、反轉錄酶試劑盒(12574018)、蛋白提取試劑盒(AM1556)、BCA試劑盒(23227)購自賽默飛世爾中國公司；鼠抗人SIRT1抗體(ab17193)購自美國abcam公司；GAPDH(sc-47724)購自美國Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1動物分組、造模及處理 將大鼠分為正常組、模型組、假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組。除正常組外，均參照文獻〔6〕左側大腦中動脈線栓閉塞法制作，構建腦卒中大鼠模型。在大鼠頸外動脈分叉處結扎頸動脈，在近心端結扎頸總動脈，在頸總動脈近頸內、頸外動脈分叉處剪一小口，將尼龍線(直徑0.2 mm)順勢緩慢插入大腦中動脈，栓塞大腦中動脈起始端的血流，然后以尼龍線結扎頸總動脈。造模成功標準：大鼠蘇醒后右側肢體疼痛回縮遲鈍或消失；提尾倒懸時右上肢向胸前屈曲；行走時右側傾倒或向右轉圈；左側出現霍納征。排除標準：造模不成功；中途死亡。模型制備成功后，將假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組大鼠固定，待大鼠安靜后，電針組于每天上午9∶00～11∶00對大鼠百會穴、大椎穴〔7〕進行電針處理，頻率2 Hz，強度3 mA，時間20 min，刺激前經行皮膚消毒，干涉21 d。假電針刺激組于每天上午9∶00～11∶00行假電針干涉21 d(僅將針插入穴位，不給予電刺激)。假穴位刺激組于每天上午9∶00～11∶00將電針插入穴位右側1 cm處，給予電刺激，同電針處理。

1.2.2平衡木行走實驗評分 行電針刺激、假穴位電針刺激、電針刺激第1、3、14、21天分別測定運動整合及協調能力，平衡木長80 cm，寬2.5 cm，平放在距離地面高10 cm處，術前1 w每天早晚各訓練1次,每次10 min,使其能順利在平衡木上行走，按Feeney 5級計分〔8〕標準0分，可正常穿過平衡木；1分，穿過平衡木，但小于一半的路程中出現腳滑現象；2分，穿過平衡木，但有大于50%的路程中出現腳滑現象；3分，可穿過平衡木，但癱瘓側后肢拖行；4分，無法穿過平衡木，但可在平衡木上保持平衡；5分，將大鼠放在平衡木上會掉下來。

1.2.3抓握牽引試驗 行電針刺激、假穴位電針刺激、電針刺激第1、3、7、14、21天分別進行抓握牽引試驗，將直徑0.15 mm的鋼絲繩置于距離地面70 cm固定，下面放厚5 cm的海綿墊以防大鼠摔傷。將大鼠兩個前爪放鋼絲繩上，記錄大鼠懸掛時間〔9〕。0分，掛在繩上0～2 s；1分，掛在繩上3～4 s；2分，掛在繩上5 s；3分，掛在繩上超過5 s。

1.2.4神經功能缺損評分的監測 末次刺激結束后，參照文獻方法評估大鼠神經功能缺損評分〔10〕：0分，無神經功能障礙；1分，右前爪無法充分外展；2分，走時向右轉圈；3分，行走時向右傾倒；4分，無法自主行走，出現意識障礙。

1.2.5大鼠腦組織梗死比測量 各組大鼠末次刺激結束后，隨機抽取5只，快速斷頭取腦，冰凍20 min后去除小腦及低位腦干，從額極至枕極做2 mm連續冠狀切片，將切片置于2%的2，3，5-氧化三苯基四氮唑(TTC)染液中，37℃避光育30 min，轉移至4%多聚甲醛溶液中固定，正常腦組織呈紅色，梗死區呈白色，用眼科鑷仔細分離白色區與紅色區，參照文獻〔7〕方法分別稱重，計算梗死區占全腦的百分比作為梗死比〔11〕，梗死比(%)=白色區重量/(白色區重量+紅色區重量)/100%。剩余各組大鼠分離腦組織，一部分經固定、脫水后石蠟包埋，連續切片4 μm，進行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察腦組織病理變化情況；另一部分儲存于液氮中保存備用。

1.2.6實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)法檢測血清miR-34a水平 按照Trizol試劑盒操作說明提取1.2.5液氮中腦組織標本中總RNA，通過反轉錄酶試劑盒Superscript Ⅲ將2 μg RNA反轉錄合成cDNA。采用Real Master Mix試劑盒行qRT-PCR檢測miR-34a表達水平，PCR條件：95℃預熱10 min、(95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s)×40個循環。以U6為內參基因，采用2-ΔΔCt算法計算miR-34a相對表達量。正向引物：5′-GGGAAUAGU-AGCUGUCAAATT-3′，反向引物：5′-UUUGACAGCUACUAUUCCCTT-3′；miR-34a正向引物:5′-ACTCTACCTACATCTGGGACACT-3′，反向引物：5′-GTAGGTCCCATGGTCATCCAG-3′。試驗重復3次，取平均值。

1.2.7免疫印跡法檢測SIRT1蛋白表達 取1.2.5液氮中各組大鼠適量腦組織，RIPA裂解液裂解，充分裂解后4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白含量。取一定量蛋白質，加入上樣緩沖液，95℃煮沸5 min，離心后取上清進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。電泳后，將分離的蛋白條帶轉膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶37℃封閉2 h。加入SIRT1一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，清洗PVDF膜后，加入二抗37℃孵育2 h，洗膜。加入電化學發光(ECL)液避光顯影。Image J圖像軟件測定各蛋白條帶的灰度值，以GAPDH為內參，目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值代表目的蛋白的相對表達水平。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組平衡木試驗評分比較 正常組各時間點平衡木試驗評分差異無統計學意義(P>0.05)，模型組平衡木試驗評分于術后3 d達最頂峰，隨后下降，假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組各時間點平衡木試驗評分依次降低；與正常組相比，模型組各時間點平衡木試驗評分均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組各時間點平衡木試驗評分均顯著下降(P<0.05)；假電針刺激組與假穴位電針刺激組各時間點平衡木試驗評分差異無統計學意義(P<0.05)；與假電針刺激組、假穴位電針刺激組相比，電針刺激組各時間點平衡木試驗評分均顯著下降(P<0.05)。見表1。

2.2各組肌力測驗評分比較 正常組各時間點肌力測驗評分差異無統計學意義(P>0.05)，模型組肌力測驗評分于術后3 d達最低谷，隨后上升；假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組術后1 d、3 d、14 d、21 d肌力測驗評分依次升高。與正常組相比，模型組各時間點肌力測驗評分均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組各時間點肌力測驗評分均顯著升高(P<0.05)；與假電針刺激組相比，假穴位電針刺激組各時間點肌力測驗評分差異無統計學意義(P<0.05)，電針刺激組各時間點肌力測驗評分均顯著升高(P<0.05)；與假穴位電針刺激組相比，電針刺激組各時間點肌力測驗評分均顯著升高(P<0.05)。見表2。

表1 各組平衡木試驗評分、腦組織神經功能缺損評分及腦組織梗死比比較

表2 各組肌力測驗評分及腦組織miR-34a、SIRT1蛋白表達比較

2.3各組神經功能評分 正常組無神經功能缺損。與模型組相比，假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組大鼠腦組織神經功能缺損評分顯著降低(P<0.05)；假電針刺激組與假穴位電針刺激組大鼠腦組織神經功能缺損評分差異無統計學意義(P>0.05)；與假電針刺激組、假穴位電針刺激組相比，電針刺激組大鼠腦組織神經功能缺損評分顯著下降(P<0.05)。見表1。

2.4各組腦組織梗死比比較 正常組腦組織無梗死。與模型組相比，假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組腦組織梗死比顯著降低(P<0.05)；假電針刺激組與假穴位電針刺激組腦組織梗死比差異無統計學意義(P>0.05)；與假電針刺激組、假穴位電針刺激組相比，電針刺激組腦組織梗死比顯著下降。見表1。

2.5各組腦組織病理學改變 正常組腦組織結構完整、形態正常，神經細胞排列規則。模型組腦組織結構不清、組織疏松，神經細胞排列紊亂，胞質著色灰暗、胞核稍增大，染色深。假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組神經細胞部分恢復，且電針刺激組好于假電針刺激組與假穴位電針刺激組。見圖1。

2.6各組腦組織miR-34a及SIRT1蛋白表達 與正常組相比，模型組腦組織miR-34a水平顯著升高(P<0.05)，SIRT1蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組腦組織miR-34a顯著降低(P<0.05)，SIRT1蛋白表達顯著升高(P<0.05)；假電針刺激組與假穴位電針刺激組腦組織miR-34a、SIRT1蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05)；與假電針刺激組、假穴位電針刺激組相比，電針刺激組腦組織miR-34a顯著降低(P<0.05)，SIRT1蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表2、圖2。

箭頭代表神經細胞圖1 各組腦組織病理切片(HE，×200)

1～5：正常組，模型組，假電針刺激組，假穴位電針刺激組，電針刺激組圖2 各組腦組織SIRT1蛋白

3 討 論

電針刺激是中醫學中針灸的一種療法，具有針灸和電療的雙重特點，其療效及安全性已經過驗證。普遍認為針刺鎮痛是一個生理性調整過程，是痛覺傳入信號與穴位傳入在中樞神經系統能相互作用的結果，神經、體液因素在其中發揮重要作用〔12，13〕。研究顯示，通過對大鼠迷走神經進行電刺激可部分恢復大鼠中動脈阻斷/再灌注損傷大鼠腦損傷〔14〕。Shi等〔15〕研究發現，電針刺激可改善缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的神經功能，減少腦梗體積，降低腦組織中的炎癥因子及興奮性氨基酸的水平，發揮神經保護作用。本研究結果提示成功構建腦卒中大鼠模型，電刺激、穴位刺激及電針刺激均對腦梗死大鼠神經功能具有一定的恢復作用，而電針刺激療效遠好于假電針刺激與假穴位電針刺激，提示電針刺激對保護動脈閉塞大鼠神經功能，部分恢復梗死比具有優越性，這可能由于電針刺激具有改善神經的傳導功能、促進神經再生與修復等功能，可改善神經組織的微血管環境，能增加脊髓和外周神經的神經營養因子，從而提高患者痛閾、增加疼痛的耐受力、降低疼痛的敏感性〔16〕。

miR-34a是位于染色體1p36，主要表達于腦組織〔17〕。周成芳等〔18〕研究顯示，大鼠腦缺血再灌注損傷模型中腦組織miR-34a水平異常升高。研究表明，SIRT1是miR-34a的靶蛋白，miR-34a可調控SIRT1參與阿霉素誘導的心肌細胞凋亡〔19〕。SIRT1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的蛋白去乙酰化酶，具有延緩細胞衰老的作用〔5〕。近年來，SIRT1的神經保護作用受到廣泛關注，Carloni等〔20〕研究顯示，腦缺血再灌注損傷過程中，SIRT1可通過抑制p53和核因子(NF)-κB介導的炎癥反應和細胞凋亡保護神經損傷。趙秀芹等〔21〕研究發現，丁苯酚注射液通過上調SIRT1表達減輕腦缺血再灌注大鼠腦損傷。本研究表明電針刺激顯著降低miR-34a，促進SIRT1蛋白表達，提示電針刺激可能通過協同激活miR-34a/SIRT1通路改善腦卒中大鼠神經功能。

綜上所述，電針刺激可能通過激活miR-34a/SIRT1通路，促進大鼠神經功能恢復，本研究也存在一定不足，電針刺激恢復大鼠神經功能的相關通路有待進一步探討。