長鏈非編碼RNA UCA1通過靶向調控miR-613進而調控乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲

陸小琴 牛司強 毛素芳

(1雅安職業技術學院藥學與檢驗學院，四川 雅安 625000；2重慶醫科大學附屬第一醫院檢驗科；3隆昌市人民醫院藥劑科)

乳腺癌是嚴重威脅我國婦女健康的惡性腫瘤，疾病負擔日益加重，其具體的發病機制仍不清楚〔1〕，因此尋找新的治療方案及作用靶點對乳腺癌的預防和治療具有重要的臨床意義。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是指長度大于200 bp的不編碼蛋白的RNA，近些年來發現它與腫瘤的發生發展有一定關系〔2〕。LncRNA在腫瘤中異常敏感，可作為腫瘤診斷的特異標記物〔3〕。在乳腺癌的研究中，LncRNA多為促癌因子，較少一部分為抑癌因子，研究LncRNA的作用和分子機制，將為乳腺癌的診斷和治療提供新靶點和新思路〔4〕。尿路上皮癌胚抗原(UCA)1 最初是在膀胱癌中發現并命名的一種長鏈非編碼RNA〔5〕。研究發現UCA1在膀胱癌〔6〕、乳腺癌〔7〕、黑色素瘤〔8〕等多種腫瘤中表達異常，能夠通過調控信號通路或作為競爭性內源RNA(ceRNA) 影響腫瘤的發生發展及對化療藥物的敏感性〔9〕。

miRNA是一類轉錄后表達調控的非編碼小分子RNA，調控細胞的發育、分化，是潛在的腫瘤分子標志物，在腫瘤的早期診斷、治療、預后判斷及化療耐藥中都有良好的應用前景〔10〕。miRNA在肺癌〔11〕、乳腺癌〔12〕和前列腺癌〔13〕等多種腫瘤中差異性表達顯著。miR-613可作為卵巢癌〔14〕、食管鱗狀細胞癌〔15〕預后標志物。本研究將探尋LncRNA UCA1通對乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響，分析UCA1和miR-613的靶向關系。為尋找有效生物靶標、實現乳腺癌的精準治療提供一定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人乳腺上皮細胞株HBL-100和人乳腺癌細胞MDA-MB-231均購于中科院細胞庫。胎牛血清、DMEM培養基購自Gibco公司；反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自Takara公司；Trizol、LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司；MTT試劑盒購自碧云天公司；載體質粒由上海生工公司構建；細胞板、酶標儀購自Bio-Rad公司。

1.2細胞培養 人乳腺上皮細胞株HBL-100和人乳腺癌細胞MDA-MB-231常規培養于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基，置于37℃，含5% CO2恒溫箱培養。每2～3 d傳代一次。

1.3細胞轉染和分組 取常規培養的人乳腺癌細胞MDA-MB-231消化后接種于6孔板中，待細胞生長至80%融合，更換為無血清培養基同步化12 h，隨后進行轉染。轉染分為空轉染(si-con)組、抑制轉染(si-UCA1)組、空轉染(miR-con)組、過表達轉染(miR-613)組(轉染miR-613 mimics)、空轉染(pcDNA)組、過表達轉染(pcDNA-UCA1)組、si-UCA1+anti-miR-con組、si-UCA1+anti-miR-613組，轉染按照LipofectamineTM 2000試劑盒進行操作。

1.4qRT-PCR分析UCA1及miR-613表達水平 按照Trizol說明書提取總RNA，用反轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，按照AceQ qPCR SYBR? Green Mix說明書進行qRT-PCR方法擴增。循環條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.5MTT法測定抑制表達UCA1、過表達miR-613和miR-613抑制表達逆轉si-UCA1對MDA-MB-231細胞增殖的影響 分別取si-con組、si-UCA1組、miR-con組、miR-613組、si-UCA1+anti-miR-con組和si-UCA1+anti-miR-613組的對數生長期細胞消化后，接種于96孔板(5×103個/孔)培養，分別于24 h、48 h和72 h培養時間點，每孔加入20 μl(5 g/ L)的MTT溶液，繼續孵育4 h；棄去多余培養基并加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)振蕩反應10 min，酶標儀測定各孔490 nm波長處光密度(OD)值。每組設3個復孔取均值，另設單孔只加培養基作空白對照。以上實驗重復3次。

1.6Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 收集si-con組、si-UCA1組、miR-con組、miR-613組、si-UCA1+anti-miR-con組和si-UCA1+anti-miR-613組穩定表達的MDA-MB-231細胞，無血清培養基制細胞懸液，接種于 Transwell 小室上層(3×103個/孔)。Transwell小室風干后，加入500 μl 0.1%結晶紫染色，顯鏡下拍照并計數發生遷移的細胞數量。細胞侵襲實驗在Transwell小室上層加入50 μl 2.0 mg/ml基質膠，凝固后接種MDA-MB-231細胞，之后同細胞遷移操作。倒置顯微鏡下隨機選取5個視野進行細胞的計數，重復3次。

1.7熒光素酶報告基因檢測實驗檢測UCA1對miR-613的轉錄調控 TargetScan數據庫顯示UCA1 3′UTR區域有miR-613結合位點。構建野生型和突變型基因靶點UCA1的3′UTR-熒光素酶表達載體(WT-UCA1和MUT-UCA1)，取對數生長期MDA-MB-231細胞接種于24孔板(5×104個/孔)，待細胞生長至80%融合時，用LipofectamineTM2000分別共轉染WT-UCA1與miR-613 mimics或miR-con、MUT-UCA1與miR-613 mimics或miR-con。依據說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進行統計學分析。實驗重復3次。

1.8統計學分析 采用SPSS20.0進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1UCA1和miR-613在人乳腺上皮細胞HBL-100和人乳腺癌細胞MDA-MB-231中的表達 與HBL-100細胞相比，MDA-MB-231細胞中UCA1的表達水平顯著升高，miR-613表達水平顯著下降(均P<0.001)。見表1。

2.2抑制UCA1表達對乳腺癌細胞增殖的影響 與si-con組相比，在48 h和72 h時si-UCA1組MDA-MB-231細胞活性顯著降低(P<0.05)。可見，抑制UCA1表達可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖。見表2。

表1 UCA1和miR-613在HBL-100細胞和MDA-MB-231細胞中的表達

表2 抑制UCA1表達對乳腺癌細胞增殖的影響

2.3抑制UCA1表達對乳腺癌細胞遷移、侵襲的影響 與si-con組比較，si-UCA1組乳腺癌細胞遷移和侵襲數量顯著降低(均P<0.001)。可見，抑制UCA1表達可抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲。見表3、圖1。

表3 抑制UCA1表達對乳腺癌細胞遷移、侵襲的影響

圖1 抑制UCA1表達對乳腺癌細胞遷移和侵襲的影響(Transwell,×200)

2.4過表達miR-613對乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響 與miR-con組比較，miR-613組乳腺癌細胞在48 h和72 h時細胞活性顯著降低(P<0.05)。與miR-con組比較，miR-613組乳腺癌細胞遷移和侵襲數量顯著降低(均P<0.001)。可見，過表達miR-613可抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。見圖2、表4。

圖2 過表達miR-613對乳腺癌細胞遷移、侵襲的影響(Transwell，×200)

表4 過表達miR-613對乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.5UCA1靶向調控miR-613的表達 通過TargetScan數據庫預測到UCA1與miR-613存在結合位點(圖3)。熒光素酶報告基因檢測實驗結果(表5)顯示，共轉染WT-UCA1與miR-613 mimics的細胞的熒光素酶活性顯著低于共轉染WT-UCA1與miR-con的細胞(P<0.01)，而共轉染MUT-UCA1與miR-613 mimics的細胞熒光素酶活性與共轉染MUT-UCA1與miR-con的細胞比較差異不顯著。相較于si-con組(0.49±0.06)，si-UCA1組(1.17±0.12)乳腺癌細胞中miR-613的表達水平顯著升高；而相較于pcDNA組(0.53±0.06)，pcDNA-UCA1組(0.19±0.03)乳腺癌細胞中miR-613的表達水平顯著降低(P<0.05)。可見，UCA1是miR-613的靶基因。

圖3 UCA1的3′UTR中含有與miR-613互補的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.6抑制miR-613表達逆轉了抑制UCA1表達對MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲的作用 在48 h和72 h時，與si-con組比較，si-UCA1組MDA-MB-231細胞活性顯著降低；而與si-UCA1+anti-miR-con組比較，si-UCA1+anti-miR-613組MDA-MB-231細胞活性顯著升高(P<0.05)。與si-con組比較，si-UCA1組MDA-MB-231細胞遷移和侵襲數顯著降低；而與si-UCA1+anti-miR-con組比較，si-UCA1+anti-miR-613組MDA-MB-231細胞遷移和侵襲數顯著升高(P<0.01，P<0.001)。見圖4、表6。可見，抑制miR-613表達可逆轉抑制UCA1表達對MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

圖4 抑制miR-613表達逆轉了抑制UCA1表達對MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的作用(Transwell,×200)

表6 抑制miR-613表達逆轉了抑制UCA1表達對MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲的作用

3 討 論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，腫瘤的轉移是造成乳腺癌死亡的主要原因〔16〕。研究發現LncRNA在腫瘤診斷和治療方面具有良好的臨床應用前景，將成為新型腫瘤診斷標志物和腫瘤治療的靶點〔17〕。LncRNA在乳腺中異常表達、功能失調，導致正常乳腺功能的異常改變，是乳腺腫瘤形成的重要因素，與它的轉移有關〔18〕。UCA1是一種LncRNA，UCA1水平在人類原發性乳腺腫瘤中顯著增強，敲低UCA1可抑制蛋白酶B(AKT)磷酸化，消除巨噬細胞誘導的腫瘤細胞的侵襲性〔19〕。UCA1在膀胱癌中高表達，且負向調節miRNA-99b〔20〕；UCA1對膀胱癌有高度特異性和敏感性，可作為診斷其標記物〔21〕。LncRNA在胃癌中異常高表達，下調UCA1可明顯抑制胃癌細胞增殖〔22〕。在食管癌組織中UCA1差異下調表達，或參與食管癌發生發展〔23〕。UCA1在肝癌轉移過程中高表達，可作為肝癌轉移診斷和病情監測的標志物〔24〕。UCA1在結腸癌中上調表達，與結腸癌的進展及患者的不良預后密切相關〔25〕。UCA1在胰腺癌組織中高表達，沉默UCA1可抑制胰腺癌細胞的體外遷移和侵襲〔26〕。

miRNA與LncRNA相互作用共同調控腫瘤進展〔27〕，與患者臨床預防、診療及預后密切相關〔28〕。最新研究表明miRNA與乳腺癌的侵襲和轉移密切相關，miR-10b〔29〕、miR-373和miR-520c〔30〕促進乳腺癌細胞的侵襲與轉移，miR-335和miR-126〔31〕則抑制乳腺癌的轉移。miRNA-613在甲狀腺乳頭狀癌組織中低表達，與其侵襲性相關〔32〕。miR-613通過靶向形態發生紊亂關聯激活因子1/RAS同源基因家族成員A(Daam1/RhoA)信號傳導途徑參與三陰性乳腺癌細胞的遷移和侵襲〔33〕。miR-613通過靶向腦源性神經營養因子(BDNF)抑制胃癌腫瘤細胞增殖，遷移和侵襲，是它的潛在治療靶標〔34〕。miR-613在肝細胞癌中顯著低表達，與預后不良有關〔35〕。miR-613通過靶向Frizzled7抑制前列腺癌細胞的增殖和侵襲〔36〕。miR-613通過調節SphK2抑制乳頭狀甲狀腺癌的細胞生長，遷移和侵襲〔37〕。

UCA1與miRNA之間相互作用可以調控相關腫瘤的發生發展。UCA1通過競爭性抑制miR-18a增強乳腺癌細胞的他莫昔芬治療耐藥〔38〕。UCA1通過阻止miR-18a抑制YAP1使乳腺癌細胞對曲妥珠單抗脫敏〔39〕。UCA1通過與p27 mRNA競爭異質性細胞核核糖核蛋白(hnRNP)I來抑制p27蛋白水平而促進乳腺腫瘤生長〔7〕。在膀胱癌細胞中UCA1負向調節miRNA-99b的表達〔40〕。miR-216b在體外培養細胞中加速UCA1的降解〔41〕；上調的UCA1通過抑制miR-216b和激活成纖維細胞生長因子受體1/細胞外信號調節激酶(FGFR1/ERK)信號通路促進肝細胞癌的進展〔42〕。

本研究發現，miR-613在乳腺癌MDA-MB-231細胞中呈現低表達，說明其可能參與調控結腸癌的發生發展。通過轉染miR-613 mimics研究了miR-613對結腸癌乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲的影響，結果顯示過表達miR-613可以抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲。在MDA-MB-231細胞中同時轉入si-UCA1和miR-613抑制表達質粒，可逆轉si-UCA1的增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，LncRNA UCA1可抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，其機制可能與靶向miR-613有關，為乳腺癌的靶向治療提供新靶點。