miR-203a-3p靶向JDP2基因調控結腸癌細胞增殖、侵襲和遷移

王一祺 修文超 徐明

(山東大學齊魯醫院(青島)肛腸科，山東 青島 266002)

結腸癌是發病率和死亡率均較高的常見惡性腫瘤，其發生發展過程受多基因、多階段的復雜調控，所以從分子層面精準靶向醫療可有效提高結腸癌的療效，對其預防和早期診斷也具有重要意義〔1〕。miRNA是一類非編碼小分子單鏈RNA，研究發現多種miRNA在結腸癌患者中表達失衡，參與癌癥的發生和進展過程，是結腸癌早期診斷、預后預測的潛在分子生物學標志物和治療靶點〔2〕。miR-203a-3p通過抑制鼻咽癌中的LIM和SH3結構域蛋白(LASP)1抑制細胞增殖和轉移〔3〕；miR-203a-3p可通過下調靶基因蛋白質精氨酸甲基轉移酶(PRMT)5的表達抑制胃癌細胞增殖〔4〕；lncRNA HOTAIR通過上調miR-203a-3p的表達水平和Wnt/β-連環蛋白(catenin)信號通路的活性來抑制結腸癌增殖，降低化學耐藥性〔5〕。Jun二聚化蛋白(JDP)2是一種參與組蛋白乙酰化的轉錄因子，其通過改變染色質結構調控基因轉錄進而在細胞的生理或病理活動中發揮功能作用〔6〕。研究發現JDP2是一種新的抑癌因子，通過多種途徑抑制惡性腫瘤的早期侵襲和轉移，JDP2可通過不同通路抑制人胰腺癌上皮向間質轉化〔7〕。但miR-203a-3p調控JDP2基因對結腸癌細胞生物學行為的影響還未有報道，本研究探討miR-203a-3p調控JDP2對結腸癌細胞的生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1材料 結腸癌細胞SW480、SW620、LOVO、HT29和人正常結腸黏膜上皮細胞NCM460購自中國科學院上海細胞庫；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、噻唑藍(MTT)試劑盒購自Sigma公司；Matrigel膠、Transwell小室購于美國BD公司；放射免疫沉淀測定(RIPA)蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；抗兔IgG二抗、兔源β-actin、JDP2、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、周期蛋白依賴性激酶(CDK)1、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9多克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.2細胞培養 SW480、SW620、LOVO、HT29和NCM460細胞均采用Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培養液(含10%胎牛血清)孵育，培養箱設置為37 ℃、含5% CO2、飽和濕度。

1.3轉染與分組 將80%融合的對數期HT29細胞(接種96孔板)用無血清RPMI1640同步化12 h，隨后按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行轉染。根據轉染序列片段和質粒的不同分為miR-203a-3p組、miR-con組(轉染miR-con)、anti-miR-203a-3p組、anti-miR-con組、pcDNA組、pcDNA-JDP2組、anti-miR-203a-3p+si-con組、anti-miR-203a-3p+si-JDP2組。

1.4qRT-PCR檢測miR-203a-3p和JDP2 mRNA表達水平 Trizol試劑提取總RNA，檢測RNA純度和濃度合格后，按照反轉錄試劑盒合成cDNA，以β-actin為內參按照熒光定量試劑盒使用說明進行qRT-PCR。采用2-△△Ct法計算miR-203a-3p和JDP2 mRNA相對表達量。

1.5Western印跡檢測蛋白的表達 在RIPA裂解液中裂解各組HT29細胞，蛋白定量后每組取50 μg蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE，利用濕法轉膜裝置并轉膜，設置電流為300 mA、時間30 min。5%脫脂奶粉封閉膜后。在4℃下加入1∶1 000稀釋一抗孵育膜過夜；室溫條件下加入1∶2 000稀釋二抗孵育2 h。隨后進行暗室顯影、定影。Quantity One軟件用于檢測蛋白條帶灰度值，JDP2、CyclinD1、CDK1、MMP-2、MMP-9蛋白與β-actin的灰度值之比即目的蛋白表達水平。

1.6MTT檢測細胞增殖 在96孔板培養24 h、48 h、72 h的每孔HT29細胞中補充20 μl MTT溶液(5 g/L)，孵育4 h后用二甲基亞砜(DMSO)溶解晶體，酶標儀測定吸光度(A)值，波長為490 nm。實驗組與空白對照組的A值百分比計算細胞活性(%)。

1.7Transwell檢測細胞遷移和侵襲 調整各組HT29細胞濃度為2×104個/ml無血清RPMI1640。取4×103個細胞加入Transwell上室(侵襲實驗時包被基質膠，遷移實驗時未包被)。取500 μl完全培養基加入下室。培養24 h后，用4%多聚甲醛固定穿膜HT29細胞，30 min后用0.1%結晶紫染色10 min，顯微鏡下觀察、統計，以隨機選取5個視野的平均值表示侵襲或遷移細胞數。

1.8熒光素酶報告基因檢測實驗檢測 miR-203a-3p 對JDP2的靶向調控構建含miR-203a-3p結合位點的JDP2野生型(WT)或突變型(MUT)3′UTR-熒光素酶表達載體(JDP2-WT和JDP2-MUT)，用LipofectamineTM2000將JDP2-WT和JDP2-MUT分別與miR-con、miR-203a-3p共轉染。熒光素酶報告基因檢測儀測定轉染48 h各組HT29細胞熒光素酶活性和Renilla活性，實驗結果以二者的比值表示。

1.9統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1miR-203a-3p和JDP2在人正常結腸黏膜上皮細胞株與結腸癌細胞中的表達 SW480、SW620、LOVO、HT29細胞中miR-203a-3p的表達較NCM460細胞顯著增加，JDP2 mRNA和JDP2蛋白表達較NCM460細胞顯著減少(均P<0.05)。見表1和圖1。結腸癌細胞中miR-203a-3p高表達，JDP2低表達；選擇表達差異最顯著的HT29細胞用于后續實驗。

表1 miR-203a-3p和JDP2在NCM460、SW480、SW620、LOVO、HT29細胞中的表達

圖1 各組JDP2蛋白表達

2.2干擾miR-203a-3p對HT29細胞增殖影響 與anti-miR-con組相比，anti-miR-203a-3p組HT29細胞中miR-203a-3p的表達水平、細胞活性、CDK1和CyclinD1蛋白表達水平均顯著降低(均P<0.05)。見圖2和表2。

圖2 檢測HT29細胞中CDK1和CyclinD1的表達

表2 干擾miR-203a-3p表達對HT29細胞增殖的影響

2.3干擾miR-203a-3p對HT29細胞遷移侵襲和遷移相關蛋白表達的影響 anti-miR-203a-3p組HT29細胞的遷移及侵襲數量較anti-miR-con組顯著降低約65.02%和63.35%(P<0.05)，MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平較anti-miR-con組顯著降低(P<0.05)。見表3、圖3、4。

表3 干擾 miR-203a-3p對HT29細胞增殖相關蛋白和遷移相關蛋白表達的影響

圖3 兩組HT29細胞遷移和侵襲(結晶紫染色，×200)

1～2：anti miR-con組，anti-miR-203a-3p組圖4 兩組MMP-2和MMP-9的表達

2.4miR-203a-3p對JDP2的靶向作用軟件TargetScan對miR-203a-3p與JDP2之間的靶向結合預測結果 見圖5。結腸癌HT29細胞的熒光素酶活性在miR-203a-3p組與JDP2-WT載體共轉染后顯著低于miR-con組(P<0.05)；而其在miR-203a-3p組與JDP2-MUT載體共轉染后無明顯變化(P>0.05)，見表4。miR-203a-3p組結腸癌HT29細胞中JDP2的表達水平(0.11±0.02)較miR-con組(0.24±0.06)顯著降低；anti-miR-203a-3p組結腸癌HT29細胞中JDP2的表達水平(0.63±0.05)較anti-miR-con組(0.26±0.04)顯著升高(P<0.05)，見圖6。

圖5 JDP2的3'UTR中含有與miR-203a-3p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

1～4：miR-con組,miR-203a-3p組,anti-miR-con組,anti-miR-203a-3p組圖6 結腸癌HT29細胞中JDP2的表達

2.5過表達JDP2抑制HT29細胞增殖、遷移和侵襲 與pcDNA組相比，pcDNA-JDP2組HT29細胞活性、細胞遷移和侵襲數量均顯著降低(均P<0.05)，JDP2的表達水平顯著升高(P<0.05)，CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖7、表5。

2.6沉默JDP2表達部分逆轉干擾miR-203a-3p對HT29細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用 與anti-miR-203a-3p+si-con組相比，anti-miR-203a-3p+si-JDP2組HT29細胞活性顯著增加(P<0.05)，細胞遷移和侵襲數量顯著升高(P<0.05)，JDP2的表達水平顯著降低(P<0.05)，CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平均顯著升高(P<0.05)。見表6、7，圖8。

1～2：pcDNA組,pcDNA-JDP2組圖7 各組HT29細胞增殖相關蛋白和遷移相關蛋白表達

表5 過表達JDP2表達對HT29細胞增殖、遷移和侵襲及HT29細胞增殖相關蛋白和遷移相關蛋白的作用

表6 anti-miR-203a-3p和JDP2表達對HT29細胞增殖、遷移和侵襲的作用

表7 anti-miR-203a-3p和JDP2表達對HT29細胞增殖相關蛋白和遷移相關蛋白的作用

1～4：anti-miR-con組,anti-miR-203a-3p組,anti-miR-203a-3p+si-con組,anti-miR-203a-3p+si-JDP2組圖8 各組檢測HT29細胞增殖相關蛋白和遷移相關蛋白

3 討 論

上皮-間質轉化(EMT)在腫瘤的原位浸潤和遠處轉移扮演重要角色〔8〕，越來越多的研究發現miRNA可參與調控EMT的過程，進而影響腫瘤的侵襲及轉移〔9〕。研究發現miR-203a通過負向靶向同源異形盒基因家族成員(HOX)D3和抑制通過血管內皮生長因子受體(VEGFR)途徑的細胞信號傳導來抑制肝細胞癌細胞侵襲、轉移和血管生成〔10〕；肝細胞外泌體miR-203a-3p可誘導結腸癌細胞間充質-上皮細胞轉化〔11〕。過表達miR-203可降低結腸癌細胞的侵襲及遷移能力〔12〕；此外，miR-203可能通過調控磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基(P110α)、蛋白激酶B(AKT)1、細胞外調節蛋白激酶(ERK)2基因的表達調節結腸癌癌細胞增殖和轉移〔13〕。與鄰近的正常組織相比，miR-203a-3p在結腸癌組織中上調表達，通過靶向磷酸二酯酶(PDE)4D促進結腸癌的增殖和遷移〔14〕。本研究提示miR-203a-3p在結腸癌細胞中表達水平顯著升高，干擾miR-203a-3p表達可降低HT29細胞增殖、遷移和侵襲能力；下調CDK4、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達水平且miR-203a-3p可靶向調控JDP2的表達。

JDP2是轉錄因子的活化蛋白(AP)-1家族的成員，也是AP-1的抑制劑；JDP2過表達抑制AP-1信號傳導保護心肌細胞免于肥大和凋亡誘導〔15〕；JDP2缺乏會促進心臟肥大和對壓力超負荷的功能障礙〔16〕。JDP2的高表達與肝癌患者的生存率相關，可作為肝癌的腫瘤抑制劑〔17〕；miR-501通過靶向JDP2促進肝細胞癌的EMT〔18〕。而JDP2過表達可引起小鼠心臟功能障礙〔19〕；JDP2通過p16Ink4a-pRb和Arf-p53途徑控制缺氧誘導的復制衰老〔20〕。而且JDP2還能促進神經母細胞瘤細胞的分化，此過程中CyclinD1表達水平降低〔21〕。本研究提示JDP2在結腸癌細胞中的水平減少，過表達JDP2可下調CDK4、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達，并降低HT29細胞增殖、遷移和侵襲能力且干擾miR-203a-3p抑制HT29細胞生物學行為的結果被沉默JDP2表達所逆轉。

綜上，干擾miR-203a-3p可通過上調JDP2的表達抑制結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，miR-203a-3p/JDP2途徑可能是結腸癌的預防、早期診斷、治療和預后預測的新靶點。