Sh-RNAi對NG108-15細胞膜受體基因TNF-R1的干擾

夏九成 龍廷 秦達念

(1攀枝花學院生物與化學工程學院，四川 攀枝花 617000；2汕頭大學醫學院生理教研室)

腫瘤壞死因子(TNF)-α通常是由激活的免疫系統所產生，對許多腫瘤細胞具有明顯的細胞毒性，可在特定動物模型中引起腫瘤的消退。通常，TNF-α被認為是促炎性因子誘導細胞凋亡〔1，2〕。但最近卻發現在特定病理及生理條件下，TNF-α的功能具有雙向性，即有時誘導細胞組織的壞死凋亡，有時則是促進組織細胞的再生〔3，4〕。組織和細胞的類型、TNF-α受體的構成、TNF-α作用的時機及作用時間的長短都可以影響TNF-α在體內的作用方向和結果。TNF-α的信號傳導依賴于細胞膜上兩個截然不同的受體發揮作用。分別是TNF受體(TNF-R)1(55 kD)和TNF-R2(75 kD)。TNF-R1在大多數組織細胞內穩定表達，而TNF-R2主要在免疫組織和細胞內進行可調控性表達。 在多數情況下，TNF-R1是主要的TNF-α信號介導因子，可以介導各類炎癥反應，從而引起機體產生病變〔4～6〕。

NG108-15細胞株是一個由小鼠神經母細胞瘤與大鼠神經膠質瘤細胞雜交后獲得細胞株系〔7〕。其中，小分子化合物雙丁酰環磷酸腺苷(dc-AMP)可以誘導NG108-15細胞分化形成成熟的神經元細胞。許多研究機構均采用該細胞系作為細胞模型來研究神經元的功能變化〔8，9〕。

本研究針對小鼠TNF-R1基因序列的不同區段，設計了4組候選sh-RNAi干擾序列試圖敲低TNF-R1在NG108-15細胞內的表達，以確定最佳的sh-RNAi干擾序列〔10～14〕。并研究sh-RNAi干擾序列對NG108-15細胞內的阿黑皮素原(POMC)、神經肽(NP)Y、刺鼠基因相關蛋白(AGRP)神經內分泌基因是否存在干擾〔15，16〕。

1 材料與方法

1.1實驗材料 NG108-15細胞系，PIPZ-1質粒載體，DH5a大腸桿菌。

1.2實驗試劑與藥品 DMEM培養基、胎牛血清、雙抗(青霉素+鏈霉素，Gibco),dc-AMP、氨芐霉素、嘌呤霉素(Sigma)，RNA提取試劑盒、RNA逆轉錄試劑盒、SYBR熒光定量PCR試劑盒(Takara)，Xhol和EcoR-1限制性內切酶，T4DNA連接酶(NEB)，轉染試劑脂質體Lipo2000(Invitrgen)，質粒提取試劑盒，DNA分子marker(天根生物)，LB固體培養基，LB液體培養基，瓊脂糖，溴化乙錠，大腸桿菌感受態細胞制備試劑盒(生工)。

1.3實驗方法

1.3.1NG108-15細胞的分化培養 將NG108-15細胞按1×104細胞/ml密度接種到直徑為35 mm的細胞培養板上，加入1 ml DMEM培養基進行培養。培養2 d后，加入含1 mmol/L dc-AMP的DMEM培養基進行分化培養。此后每隔3 d換液一次，7 d后待細胞完全分化出細胞突觸后，收集所培養細胞待用。

1.3.2針對TNF-R1設計的sh-RNAi干擾序列 sh-RNAi干擾序列均根據小鼠TNF-R1基因的mRNA(NM_011609.4)，利用siDirect軟件來設計，sh-0為空白對照，空載質粒；Sh-1、Sh-2、Sh-3、Sh-4具體序列見表1。

表1 小鼠TNF-R1的sh-RNAi干擾序列

1.3.3sh-RNAi重組質粒載體的構建 載體(PIPZ-1，圖1)由汕頭大學醫學院顧巍教授實驗室惠贈。將PIPZ-1質粒通過轉染試劑轉入DH5a大腸桿菌進行質粒的擴增，并通過質粒提取試劑盒提取質粒放入-20℃冰箱保存備用。將提取純化的質粒，利用Xhol 和EcoR-1(NEB)限制性內切酶進行雙酶切，以保證干擾序列的定向插入。然后利用T4DNA將干擾序列連接到PIPZ-1載體上。

1.3.4sh-RNAi重組DNA轉入NG108-15細胞 當NG108-15細胞生長密度達到70%～90%后，將重組sh-RNAi的載體分子利用Lipo2000(Invitrogen)將其轉入受體細胞內。利用5 μg/ml嘌呤霉素(Solarbio)篩選獲得轉化細胞。

1.3.5TNF-R1基因表達的熒光定量檢測 用100 pg/ml TNF-α孵育轉化細胞12 h后，收集每一個培養孔中的轉化細胞，加入0.5 ml的RNA提取試劑(Takara)提取總RNA，用50 μl超純水稀釋后-70℃保存。cDNA的合成利用逆轉錄試劑盒(Takara)完成，之后的PCR在熒光定量PCR儀(ABI7500)上進行，擴增程序為95℃，5 s；60℃，34 s；40個循環，擴增試劑為SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara)。擴增引物序列見表2，試驗結果用2-ΔΔCt相對定量法進行數據分析。

圖1 PIPZ-1載體的結構(8 075 bp)

表2 熒光定量PCR的引物序列

1.3.6POMC、NPY、AGRP神經內分泌基因受干擾的檢測 在確認最佳的TNF-R1干擾系列后，將其導入成熟的NG108-15細胞中，利用熒光定量PCR檢測此干擾系列對神經內分泌基因POMC、NPY和AGRP是否存在干擾效應。基因引物序列見表3。

表3 POMC、NPY和AGRP基因的引物序列

2 結 果

2.1NG108-15細胞的誘導分化 NG108-15細胞出現分化，部分細胞間出現突觸聯系，說明具有了神經元細胞的形態特征。見圖2。

圖2 NG108-15細胞的形態特征(×100)

2.2sh-RNAi干擾TNF-R1 Sh-1、Sh-2、Sh-3、Sh-4、Sh-0干擾序列TNF-R1相對表達量分別為：0.445±0.32、0.679±0.14、0.834±0.41、0.561±0.26、1.000±0.24。Sh-1干擾序列對TNF-R1基因具有最好的干擾效果，可將其作為本試驗的最佳干擾序列進行后續的干擾試驗。

2.3Sh-1干擾序列對POMC、AGRP、NPY基因的表達影響 Sh-1干擾序列對POMC、AGRP和NPY基因的表達均有顯著影響，尤其對AGRP基因的影響最顯著(調低45.4%)。見表4。

表4 sh-1干擾序列對POMC、NPY和AGRP基因表達的影響

3 討 論

本研究根據小鼠TNF-R1基因的mRNA序列設計了4組sh-RNAi干擾序列導入分化后的NG108-15細胞。從干擾結果來看，sh-1的干擾結果最佳。而sh-1干擾序列針對的靶區是TNF-R1受體的439～461位，此序列是TNF-R1受體的膜外半胱氨酸富集區(CRD)1。該靶區對于TNF-α與受體TNF-R1的有效結合，并對信號轉導起到關鍵作用〔4，6，10〕。同時Sh-1通過對TNF-R1的干擾，最終對下游的其他神經內分泌基因也可產生影響，使POMC、NPY和AGRP基因的表達也有不同程度降低。由此說明，對于由于細胞炎性因子TNF-α誘導的下丘腦神經內分泌疾病，可以考慮通過sh-RNAi干擾的方法降低相應的炎癥反應〔3，4，10，13〕。