維生素甲酸在中長波紫外線誘導小鼠皮膚光老化模型中的作用

李敏 趙飛

(河南省人民醫院藥學部，河南 鄭州 450003)

長期紫外線照射會引發人皮膚組織光老化，出現皮膚增厚、粗糙、色素沉積、皮革樣外觀等癥狀〔1〕；皮膚膠原纖維含量減少、變性是光老化的特征性組織學表現〔2〕。維生素甲酸是目前皮膚光老化治療的主要藥物，可通過抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)分泌來改善患者臨床癥狀〔3〕。研究發現，維生素甲酸類藥物在體內通過與維生素甲酸受體、維生素甲酸X受體特異性結合而發揮藥理學作用〔4〕。但維生素甲酸抑制光老化皮膚MMPs分泌是否與維生素甲酸受體機制有關仍未明確。本研究旨在探討維生素甲酸抑制皮膚光老化的相關機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性ICR小鼠90只，體重22～26 g，購于北京隆安實驗動物養殖中心，批號：SCXK(京)2014-0003。飼養溫度22～24℃、濕度50%～60%，12 h節律光照，自由飲食、進食。

1.2主要試劑 反式維生素甲酸、維生素甲酸受體拮抗劑、維生素甲酸受體激動劑、維生素甲酸X受體拮抗劑、維生素甲酸X受體激動劑均購于上海仁捷生物科技有限公司；兔抗人MMP3多克隆抗體、兔抗人MMP13多克隆抗體購于北京奧維亞生物有限公司。

1.3皮膚光老化模型建立 隨機將90只小鼠分為模型80只，正常對照10只進行適應性喂養。模型組第2周起開始進行長波紫外線(UVA)、短波紫外線(UVB)聯合照射，照射距離30 cm，每周照射3次，隔日進行；照射時間在第2、3、4周分別為30 min/次、45 min/次、60 min/次，第5周以后為90 min/次，共照射12 w，每次照射前剔去小鼠背部毛發。正常對照組常規喂養12 w。

1.4分組與處理 將造模的80只小鼠隨機分為：模型組、維生素甲酸組、維生素甲酸受體拮抗劑組(維生素甲酸+維生素甲酸受體拮抗劑)、維生素甲酸X受體拮抗劑組(維生素甲酸+維生素甲酸X受體拮抗劑)、維生素甲酸受體激動劑組、維生素甲酸受體激動劑聯合拮抗劑組、維生素甲酸X受體激動劑組、維生素甲酸X受體激動劑聯合拮抗劑組，每組10只。其中維生素甲酸的給藥劑量為2 mg/kg；維生素甲酸受體拮抗劑、維生素甲酸X受體拮抗劑的給藥劑量為4 mmol/kg；激動劑的給藥劑量為1.6 mmol/kg；溶劑為乙醇∶丙二醇(7∶3)，連續給藥8 w，每周給藥5次，在小鼠背部中央皮膚上外用100 μl，給藥后避光；模型組僅給予乙醇丙二醇溶劑。

1.5標本采集與制備 末次給藥后，在全麻狀態下取小鼠背部皮膚，分為2份，其中一份液氮速凍后-80℃保存，另一份多聚甲醛固定后常規行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.6Western印跡檢測 取部分凍存的皮膚組織標本，RIPA提取總蛋白，定量后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕法轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別滴加兔抗人MMP3多克隆抗體(1∶500稀釋)、兔抗人MMP13多克隆抗體(1∶500稀釋)，4℃過夜，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(1∶1 000稀釋)，室溫下靜置2 h，電化學發光(ECL)顯色，避光顯影，分析各條帶灰度值，以GAPDH為內參對照。

1.7標本組織中膠原蛋白含量檢測 取小鼠皮膚組織30 mg，堿水解-光度法測定羥脯氨酸含量，操作嚴格按試劑盒說明進行。膠原蛋白含量=羥脯氨酸含量×7.46。

1.8統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組皮膚組織病理學改變情況 正常對照組小鼠表皮結構完整，厚度正常。模型組小鼠皮膚增厚，表皮不規則，膠原束斷裂、卷曲、排列不均。維生素甲酸組、維生素甲酸X受體拮抗劑組、維生素甲酸受體激動劑組與模型組相比表皮厚度和真皮膠原纖維明顯改善，以真皮上部改善最明顯。維生素甲酸受體拮抗劑組、維生素甲酸受體激動劑聯合拮抗劑組、維生素甲酸X受體激動劑組、維生素甲酸X受體激動劑聯合拮抗劑組與模型組相比無明顯改善。見圖1。

圖1 各組皮膚組織病理學改變(HE，×200)

2.2維生素甲酸通過維生素甲酸受體對光老化皮膚MMP3和MMP13表達的影響 模型組MMP3、MMP13蛋白表達水平明顯高于正常對照組(P<0.01)，維生素甲酸組明顯低于模型組(P<0.05)，維生素甲酸受體拮抗劑組明顯高于維生素甲酸組(P<0.05)；維生素甲酸X受體拮抗劑組與維生素甲酸組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2，表1。

1～5：正常對照組、模型組、維生素甲酸組、維生素甲酸受體拮抗劑組、維生素甲酸X受體拮抗劑組圖2 各組MMP3和MMP13蛋白表達Western印跡電泳

表1 各組MMP3和MMP13蛋白相對表達量比較

2.3維生素甲酸受體激動劑對光老化皮膚MMP3和MMP13表達的影響 維生素甲酸受體激動劑組MMP3、MMP13蛋白表達水平明顯低于模型組，維生素甲酸受體激動劑聯合拮抗劑組明顯高于維生素甲酸受體激動劑組(P<0.05)。見圖3，表2。

1～4:正常對照組、模型組、維生素甲酸受體激動劑組、維生素甲酸受體激動劑聯合拮抗劑組圖3 各組MMP3和MMP13 Western印跡電泳

表2 各組MMP3和MMP13蛋白相對表達量比較

2.4維生素甲酸X受體激動劑對光老化皮膚MMP3和MMP13表達的影響 維生素甲酸X受體激動劑組MMP3、MMP13蛋白表達水平與模型組差異無統計學意義(P>0.05)；維生素甲酸受體激動劑聯合拮抗劑組與維生素甲酸受體激動劑組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4，表3。

1～4：正常對照組、模型組、維生素甲酸X受體激動劑組、維生素甲酸X受體激動劑聯合拮抗劑組圖4 各組MMP3和MMP13的Western blot電泳圖

表3 各組MMP3和MMP13蛋白相對表達量比較

2.5各組小鼠皮膚組織中膠原蛋白含量比較 正常對照組、模型組、維生素甲酸組、維生素甲酸受體拮抗劑組、維生素甲酸X受體拮抗劑組、維生素甲酸受體激動劑組、維生素甲酸受體激動劑聯合拮抗劑組、維生素甲酸X受體激動劑組、維生素甲酸X受體激動劑聯合拮抗劑組膠原蛋白含量依次為：(20.82±2.16)、(13.95±2.41)、(17.73±1.85)、(13.50±1.76)、(17.47±1.90)、(15.93±2.11)、(13.19±1.61)、(12.82±1.66)、(12.76±1.86)μg/mg。維生素甲酸受體拮抗劑組、維生素甲酸受體激動劑聯合拮抗劑組明顯低于維生素甲酸組、維生素甲酸受體激動劑組(P<0.05)。維生素甲酸X受體激動劑組與維生素甲酸組差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

真皮膠原纖維變性、含量減少是皮膚光老化的主要病理學表現〔5〕。紫外線反復照射可抑制前膠原蛋白合成，加速降解膠原蛋白，膠原蛋白含量減少引發真皮層中的膠原纖維出現病理性改變〔6〕。MMPs作為具有生物活性的胞外基質降解酶，參與皮膚光老化的發生與發展〔7〕。相關研究顯示，人體皮膚長時間暴露于紫外線下會提升MMP1、MMP3表達水平，MMP1能夠促進Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白裂解〔8〕，同時MMP3也具有明顯的膠原蛋白降解活性〔9〕。基礎研究結果顯示，MPP13可增強Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原裂解活性〔10〕。

維生素甲酸能夠抑制光老化皮膚組織中的MMPs表達，降低膠原纖維降解率，緩解光老化皮膚的發生與發展〔11〕。維生素甲酸類藥物在體內主要通過與維生素甲酸受體、維生素甲酸X受體相互結合，進而發揮藥理學作用。但維生素甲酸受體在維生素甲酸抑制皮膚光老化MMPs表達中的作用鮮有報道。本研究顯示，維生素甲酸能夠明顯抑制小鼠光老化皮膚組織中MMP3、MMP13表達水平，抑制膠原降解，提升皮膚中膠原蛋白含量，改善皮膚組織學表現；維生素甲酸受體拮抗劑可逆轉維生素甲酸對小鼠光老化皮膚MMP3、MMP13表達的抑制作用，加速膠原降解，皮膚中膠原含量明顯低于維生素甲酸組，而維生素甲酸X受體拮抗劑無上述作用。提示維生素甲酸可通過維生素甲酸受體降低皮膚組織中MMP3、MMP13蛋白表達，抑制光老化皮膚的膠原降解。

為進一步驗證上述推測，本研究使用維生素甲酸受體、維生素甲酸X受體激動劑、拮抗劑進行干預，結果顯示，維生素甲酸受體激動劑可明顯下調光老化皮膚組織中的MMP3、MMP13表達水平，與維生素甲酸具有類似作用，但維生素甲酸X受體激動劑無上述作用。與此同時，維生素甲酸受體拮抗劑可抑制激動劑的改善作用。提示維生素甲酸受體參與維生素甲酸類藥物發揮藥效學作用，但維生素甲酸X受體未見明顯作用。本實驗發現了維生素甲酸可通過維生素甲酸受體抑制光老化皮膚組織中MMP3、MMP13蛋白表達，但維生素甲酸受體包含α、β、γ3種亞型〔12〕，具體涉及哪種亞型仍需進一步研究。