安徽省某酸水庫水質與細菌結構空間分布特征

王廣成，王紹平，邵 銳 ，賈亞文，楊 程，王麗行，潘 鑫

(1．安徽馬鋼礦業資源集團南山礦業有限責任公司，安徽 馬鞍山 243000；2．合肥工業大學 資源與環境工程學院，安徽 合肥 230009；3．中鋼集團馬鞍山礦山研究總院股份有限公司，安徽 馬鞍山 243000)

1 引言

酸性礦山廢水(Acid mine drainage，AMD)是礦山開采過程中/開才結束后金屬硫化礦物(如黃銅礦、黃鐵礦)長期暴露于露天環境，在微生物驅動下，經大氣、水共同作用發生的氧化性溶解形成的酸性廢水，是世界上普遍的環境問題[1，2]。其典型特征為低pH(一般pH<3)，含有高濃度溶解性有毒金屬離子(Fe、Mg、Mn、Al等)和高濃度硫酸鹽[1～3]。未經處理的酸性礦山廢水若直接排放到環境中會污染周邊水生、陸生環境，抑制動植物生長甚至危害人類健康[4]。由于危害性大，成份復雜，處理難度高，AMD長期受到廣泛的關注研究。

作為典型的極端生態環，AMD中的微生物群落結構特征一直是研究的熱點領域[5～8]。極端微生物對于AMD的形成，演化與修復過程至關重要，如Acidithiobacillusferrooxidans能加速礦物的氧化溶解、水體酸化過程，是促進AMD形成的最普遍的菌種之一[9]。硫酸鹽還原菌是目前AMD生物反應器中最常用的功能菌屬，具有廣泛的應用前景[10～12]。因此，關注極端環境中的微生物種類對于AMD的源頭生態治理和末端治理至關重要。為全面了解酸性礦山廢水的水質和微生物結構的空間分布特征，本研究從某安徽省某酸水庫采集了不同水深的樣品進行了理化指標的表征和微生物群落的分析。

2 材料與方法

2.1 采樣位點及樣本采集

采樣點為安徽省馬鞍山市某礦山開采結束后遺留礦坑形成的酸水庫，該水庫面積約為0.1268 km2。本研究為全面監測酸水庫的動態變化和了解嗜酸微生物在不同水深空間處的分布情況，采集了不同深度梯度(水下0.5 m、5 m、10 m、15 m)的水樣和微生物樣品。水樣采用有機玻璃采樣器進行采集并使用500 mL干凈的聚乙烯采樣瓶分裝儲存；生物樣品利用0.22 μm混合纖維素脂濾膜富集。所有樣品于4 ℃低溫冷藏保存運至實驗室測量相關理化指標。

2.2 理化指標測定

每個位點的溫度(T，temperature)、pH值、溶解氧(DO，dissolved oxygen)、氧化還原電位(ORP，redox potential)利用六位參數儀進行現場測定。經預處理低溫冷藏保存的水樣過膜后采用TOC儀(耶拿multi N/C 3000，德國)測定TN、DOC、DIC含量；磷酸鹽和總磷采用鉬酸銨光譜法測定；氨氮濃度通過納氏試劑分光光度發獲得；Fe(Ⅱ)采用鄰菲羅啉分光光度法測定；硫酸鹽用離子色譜法(戴安 ICS-900，美國)進行測定；溶解性重金屬離子Cu、Zn、Mn、Mg、Ca等采用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)進行測定。

2.3 DNA提取，PCR擴增和高通量測序

所有樣品DNA采用FastDNA Spin Kit for Soil (MP Biomedical)試劑盒進行提取，用微量分光光度計測定DNA濃度。原核生物利用通用引物F515和R806擴增細菌。樣品送往廣州美格公司進微生物測序。

3 結果和討論

3.1 非金屬理化指標的垂向分布

結果表水和下層水各理化指標均存在差異，相同水深的水樣差異較小(圖1)。酸水庫表水溫度為17.0～17.2 ℃，下層水溫度為16.6～17.0 ℃，表水高于下層水并且隨著深度的增加，溫度逐漸降低，光照時間的長短和光照強度對水體溫度影響最大。表水pH值為3.33～3.46，下層水為3.51～3.69，表水pH值相對較低，隨著深度增加，pH值逐漸升高。此外，表水的溶解氧和氧化還原電位相對較高，下層水隨著深度增加溶解氧濃度和氧化還原電位降低。總體上，酸水庫呈現出明顯的水質分層。表水層為氧化環境，pH值更低，這可能是由于以下三個原因：①酸水庫周邊堆放的尾礦(以硫鐵礦為主)在水和大氣的共同作用下產生酸水并向酸水庫表水輸入[13]；②酸水庫表水亞鐵氧化為三價鐵后水解產酸：Fe3++H2O-—Fe(OH)3(s)+3H+；③次生礦物(主要為黃鉀鐵礬和施氏礦物等)的形成過程也會產生氫離子。表水中氮磷等營養元素的含量更少，可能是由于藻類的繁殖吸收了大量營養元素[14]。此外，藻類死亡后沉積至酸水庫底部，其生物質被微生物降解，從而在下水層釋放更多的營養物質。

圖1 酸水庫中物理性指標的垂向變化

3.2 金屬離子濃度的垂向分布

酸水庫表水與下層水存在較大差異(圖2)。除了鈣離子和銅離子，其他金屬離子基本表現為表水濃度遠小于下層水。表水中亞鐵和總鐵濃度分別為1.6～2.4 mg/L和98.4～119.1 mg/L，相對于下層濃度326.2～442.9 mg/L和355.4～586.0 mg/L較低，并且二價鐵在表水中占的比例較小，說明水體中鐵離子主要以三價鐵及其他形式存在。水體無機營養鹽充足，表水中的藻類微生物生長較好，使得表水溶解氧維持在較高濃度，加速了亞鐵離子的氧化，三價鐵在水中發生水解等一系列反應，導致亞鐵離子濃度遠小于下層水體。同時，該水體中含有大量硫酸根等，可促進鐵離子形成施氏礦物等，向下沉降或吸附于岸邊，使得表水中鐵離子濃度小于下層水。表水中的錳、鎂、鋁、鋅離子濃度分別為348.0～420.3 mg/L、2447.0～3184.0 mg/L、759.6～796.0 mg/L、18.2～22.2 mg/L低于下層水的濃度為669.5～852.5mg/L、4931.0～7036.0 mg/L、920.6～1169.0 mg/L、30.0～41.6 mg/L。這些金屬離子可能被水體中形成的施氏礦物等聚集體吸附，向下層水沉降[15]。另外，酸水庫表面存在豐富的微生物，經過長期馴化，已經適應低pH、高金屬離子濃度的環境，這些微生物可以通過自身分泌出的有機物上的陰離子官能團與金屬陽離子結合從而對金屬離子進行富集，并且隨著微生物消亡逐漸向下層累積。

圖2 酸水庫中金屬離子濃度的垂向變化

3.3 原核細菌的微生物分布

原核微生物測定結果如圖3所示。酸水庫中的微生物群落存在顯著分層特征，主要分為好氧異養的表層微生物和下層耐受性強的微生物。其中表水主要為變形菌門(Proteobacteria)，放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)的微生物，相對豐度分別為68.9%，24.7%，3.6%。這些微生物是水體酸化的主要承擔者，能促進硫鐵礦物的氧化溶解過程，釋放H+，金屬陽離子和硫酸鹽，以鐵和/或硫氧化菌屬，鐵還原菌屬，碳循環代謝菌屬為主[6，7]。下層水主要為厚壁菌門(Firmicutes)，變形菌門(Proteobacteria)，放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)，相對豐度依次分別為34.5%～58.0%，23.7%～49.3%，4.3%～4.9%，4.5%～6.4%。原本在表水占據優勢的酸桿菌門和放線菌門在此處豐度顯著降低，該區域微生物數量有所降低，但多樣性有著極大的提高。下層水中的厚壁菌門豐度迅速增加，其主要成員為梭菌綱和桿菌綱生物，梭菌綱中的微生物大多能通過發酵呼吸進行有機質降解，但由于嗜酸性的梭菌研究相對較少，水庫中大多為未鑒定的梭菌類菌屬；桿菌菌綱主要為Acidibacillus和Alicyclobacillus，前者為異養的鐵硫氧化菌屬，后者重金屬耐受能力強，主要通過利用有機質和其它菌屬的代謝產物進行生長，能促進鐵氧化/還原菌屬的生長[16，17]。此外，在下層水區域，能降解植物聚合物、降解纖維素和反硝化細菌的相對豐度顯著升高，這些微生物通過分解動植物植物殘骸中的有機質來為酸水庫提供碳源，同時參與水庫中的氮循化過程[18]。

圖3 門水平微生物相對豐度的垂向變化

4 結論

酸水庫中存在含量豐富，種群多樣，功能各異的嗜酸微生物，且表現出了明顯的空間結構差異。表層水中細菌主要為鐵硫氧化還原功能的變形菌門，下層水則以對環境壓力耐受性強的厚壁菌門，及參與厭氧代謝過程的變形菌門和放線菌門為主，微生物空間分層的主要推動力為水質的pH值，DO和Fe2+濃度，下層水體pH值高，亞鐵含量高，溶解氧低，適宜多種微生物生長代謝，生物多樣性更為平均；而表層水體pH值較低，受溫度，大氣氧化影響，同時水體中的固氮固碳生物能利用大氣中的氮氣和CO2支持自身生長繁殖，該區域占據優勢的大多為好氧的嗜酸異養菌屬。