固相萃取 液相色譜-質譜法測定地表水中喹諾酮類抗生素

付曉燕，劉蓮蓮

(遼寧省大連生態環境監測中心，遼寧 大連 116023)

1 引言

喹諾酮類(4-quinolones)，又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類，是人工合成的含4-喹諾酮基本結構的抗菌藥。喹諾酮類以細菌的脫氧核糖核酸(DNA)為靶，妨礙DNA回旋酶，進一步造成細菌DNA的不可逆損害，達到抗菌效果。喹諾酮類是應用比較廣泛的一類抗生素藥物，被廣泛應用于養殖業中。喹諾酮類藥物在動物機體組織中的殘留，人類食用動物組織后，喹諾酮類抗生素就在人體內殘留蓄積，極易造成人體疾病對該藥物的耐藥性，影響人體疾病的治療。一旦釋放進入環境中，便會分布到水、土壤和空氣中，產生一系列代謝及降解產物，而這些產物往往具有更大的毒性。由于喹諾酮類藥物具有強極性及在環境樣品中含量低的特點，導致對其分析檢測難度增加[2,3]。

檢測水環境中殘留抗生素，分析方法靈敏、準確、快速是其環境行為和生態效應研究的必要手段。傳統的微生物檢測方法是利用抗菌藥物敏感的菌株作為指示生物體，再根據最低抑菌濃度推算出提取液中的藥物濃度，但是該方法十分繁瑣。高效液相色譜-紫外檢測方法的選擇性不強，對于某些抗生素靈敏度不高，不能快速準確分析。液相色譜-串聯質譜法具有選擇性強、靈敏度高、簡便快速和應用范圍廣等特點，成為當前水環境中檢測痕量抗生素殘留方法的發展趨勢。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC 液相色譜儀，Waters TQ Detector 新型離子源加熱型質譜儀；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7μm )；ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×50 mm, 1.8 μm )；：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7μm )；Milli-Q超純水器；固相萃取柱：填料為二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；0.22 μm有機相針筒式微孔濾膜過濾器，材質為玻璃纖維、親水性聚丙烯、親水性聚四氟乙烯(PTFE)等。

甲醇為HPLC級(美國J. T. Baker公司)；甲酸為HPLC級(美國Sigma公司)；實驗用水為經Milli-Q凈化系統制備的超純水(經0.22 μm過濾膜)；氮氣、氬氣(純度≥ 99.999%)；其他試劑均為分析純；磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑及磺胺甲基嘧啶-13C6標準物質：純度均≥99%(百靈威公司)；

2.2 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm )，流動相為甲醇-0.1% 的甲酸水溶液 。時間分別為：0、0.5、5.0、7.0、7.5、8.5、9.0、10.0 min，甲醇濃度分別為：5%、5%、30%、30%、90%、90%、5%、5%，甲醛水溶液濃度分別為：95%、95%、70%、70%、10%、10%、95%、95%。流速0.2 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量10 μL。

2.3 質譜條件

電離方式為電噴霧電離ESI( + )，檢測方式為多反應監測(Multiple Reaction Monitor, MRM)方式，利用保留時間和碎片信號比值判斷定性結果；電噴霧電壓3 kV；離子源溫度120 ℃；去溶劑溫度350 ℃。

2.4 樣品制備

準確移取100 mL水樣，用0.45 μm濾膜過濾，HLB固相萃取柱進行萃取。萃取柱應先進行活化，活化方法為：分別用10 mL 甲醇、10 mL超純水活化HLB 萃取柱。水樣以小于5 mL/min的流速通過固相萃取柱，完成后用10 mL超純水淋洗小柱，再用氮氣吹干小柱，最后用10 mL甲醇洗脫富集固相萃取柱，并用接收管接收甲醇洗脫液，氮吹濃縮至近干，加甲酸溶液定容到1.0 mL，最后加入內標使用液10.0 μL，經0.22 μm濾膜過濾，置于進樣瓶中，等待進樣。

3 結果與討論

3.1 濾膜的選擇

由于選擇的色譜柱填料粒徑為1.7 μm比較小，因此選擇了0.22 μm的四種不同材質濾膜作比較：玻璃纖維、尼龍、親水性PTFE和聚丙烯濾膜，使用針式過濾器過濾，對空白加標樣品進行分析，5種喹諾酮類抗生素加標濃度為10 μg/L，發現濾膜樣品通過率為57%～98%，按照通過率高低順序，選擇通過率大于90%的0.22 μm的玻璃纖維濾膜、親水性聚丙烯濾膜、親水性PTFE濾膜。

3.2 液相色譜條件的優化

喹諾酮類抗生素分子具有較強的極性，在大部分反相色譜柱上,即使以純水作流動相，依然只有很弱的保留[5]，因此選擇合適的色譜柱對喹諾酮類抗生素的分析測定至關重要，本研究分別比較了ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm )、ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm )和ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)兩種類型的色譜柱對目標化合物的分離效果。結果表明ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm )色譜柱對目標物具有最佳的色譜分離效果，且在10 min內目標物完全分離。

流動相的組成不僅影響目標化合物的色譜峰形和分離效果，還會影響其離子化效率和質譜檢測靈敏度。本研究考察了不同比例有機相(30%、50%及60%) 的分離效果，最終確認甲醇-水(30∶70，V/V)為主要洗脫梯度，含0.1%的甲酸體系，具有最佳的電離效果和質譜特征。

3.3 質譜條件的優化

根據喹諾酮類抗生素的分子結構的特征和化學電離性質，實驗選擇了ESI(+)作為離子化模式。為了獲得最佳的靈敏度和分離效果，首先，采用連續直接進樣，掃描范圍為m/z 10～300，分別對電噴霧電壓、離子源溫度、去溶劑溫度、錐孔氣流量、錐孔電壓，碰撞電壓等條件進行優化，使調諧液中喹諾酮類抗生素的離子化效率達到最佳。

4 結論

本方法建立了液相色譜-串聯四級桿質譜聯用儀，對水中喹諾酮類抗生素分析快速，著重研究了液相色譜-串聯四級桿質譜聯用儀對水中喹諾酮類抗生素的快速測定。該方法通過固相萃取法進樣分析，節省了水樣前處理過程中需要消耗的大量有機溶劑及衍生試劑，并縮短了檢測時間，方法檢測限低至0.015 μg/L，是一種分析速度快、定性準確、靈敏度高、穩定性好的分析方法[10，11]。